Name: synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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apoio financeiro por parte da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), o Research Training Grupo GRK 2039 (financiado pela DFG) e KIT é reconhecido agradecimento.

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados ​​nestas sínteses são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas que são normalmente exigidos em laboratórios de química orgânica, tais como vestindo uma bata de laboratório, óculos de segurança e luvas. 1. Sintese dos corantes Nota: ambos os corantes podem ser sintetizados pelos mesmos tipos de reacção Figura 2 mostra uma visão geral destas reacções.. <ol><li> Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1) <ol><li> Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io (Figura 2A, o passo a) <ol><li> Dissolve-se 466 mg de 4-picolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo. </li><li> Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo residual e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min. </li><li> Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N. </li></ol></li><li> Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, passo b) <ol><li> Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 376 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo. </li><li> Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo. </li><li> Filtrar e descartar o precipitado resultante. </li><li> Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando uma podridãoAry evaporador para se obter o produto como um óleo castanho. </li></ol></li><li> Síntese de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído (Figura 2A, passo c) <ol><li> Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de indol-3-carbaldeído, carbonato de potássio 1,52 g e 2,70 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo. </li><li> Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h. </li><li> Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo. </li><li> Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente a 50 ° C sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li></ol></li><li> Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1) (Figura 2A, Passo d) <ol><li> Trabalhar sob árgon e sob exclusão de humidade. Dissolve 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metil-piridin-1-io e 48 mg de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo. </li><li> Adicionar 0,07 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA. </li><li> Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se três vezes com éter dietílico. </li><li> Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico. </li><li> Combinar os precipitados. </li></ol></li></ol></li><li> Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (corante 2) <ol><li> Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo a) <ol><li> Dissolve-se 715 mg de 4-metilquinolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo. </li><li> Calora 85 ° C durante 16 horas. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo remanescente e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min. </li><li> Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N. </li></ol></li><li> Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo b) <ol><li> Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 333 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo. </li><li> Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo. </li><li> Filtrar e descartar o precipitado resultante. </li><li> Remover o solvente under pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter o produto na forma de óleo castanho. </li></ol></li><li> Síntese de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído (Figura 2B, passo c) <ol><li> Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de 2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído, carbonato de potássio 0,996 g e 1,77 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo. </li><li> Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h. </li><li> Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo. </li><li> Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li></ol></li><li> Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-Phe nil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (Figura 2B, passo d) <ol><li> Obra sob argsobre e sob exclusão de humidade. Dissolve-se 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io e 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml de fundo redondo equipado com condensador de refluxo. </li><li> Adicionar 0,06 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Deixa-se arrefecer para a TA. </li><li> Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se com éter dietílico três vezes. </li><li> Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico. </li><li> Combinar os precipitados. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Síntese de cadeias de ADN Nota: A síntese das cadeias de ADN é realizada utilizando o método de fosforamidite em fase sólida, como descrito por M. Caruthers 11 em um sintetizador de ADN. O funcionamento do sintetizador é testado antes do processo de síntese, e os reagentes são renovados senecessário. <ol><li> Prearrangements <ol><li> Dissolve-se o disponível comercialmente 2&#39;-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) em 1,2 ml de diluente amidite (acetonitrilo extra-seco). Mova solução no frasco para um frasco de sintetizador e parafuso no sintetizador. </li><li> Executar um &quot;teste de vazamento&quot; (de acordo com as instruções do fabricante) para se certificar de que não existe nenhuma fuga de gás argônio. Se o &quot;teste de vazamento&quot; falhar, parafuso no frasco com mais força. </li><li> Primeiro a solução de Cu através do enchimento do tubo que liga a câmara de síntese em fase sólida. </li><li> Lave todas as linhas com acetonitrilo. </li></ol></li><li> Síntese de cadeias de ADN <ol><li> Usar o computador conectado para entrar no método sequência de ADN e de acoplamento, seguindo as instruções do protocolo do fabricante. O passo de acoplamento do bloco de construção Cu leva 168 segundos com 7 pulsos (cada impulso são 16 ul) em comparação com 40 segundos com 7 pulsos para um convencionalfosforamidite como blocos de construção. </li><li> Montar a coluna contendo o CPG (vidro de poro controlado) como fase sólida que é modificado com um umol de a primeira base (síntese de ADN é realizada a partir de 3 &#39;para 5&#39;) para o sintetizador. </li><li> Iniciar a síntese no sintetizador de ADN 11. </li></ol></li><li> A manipulação de cadeias de ADN sintetizados <ol><li> Secam-se as colunas com as cadeias de ADN sintetizada sob vácuo O / N. </li><li> Utilize uma pinça para abrir a coluna e solte o CPG para um frasco de reacção. Adicionar 700 ul de solução de amónia aquosa concentrada para desproteger o oligonucleótido e libertar a cadeia de ADN a partir do CPG. </li><li> Fechar o recipiente e aplicar uma tampa de segurança para o recipiente de reacção para evitar a sua ruptura e de calor a 50 ° C durante 18 h. </li><li> Remover a amónia por centrifugação sob pressão reduzida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Iniciar filtração a partir de CPG: navio Centrifugar a 11.000 xg foR 3 min. Aqui sobrenadante e transferi-la para um dispositivo de centrifugação com um tamanho de poro de 0,45 um. Centrifugar a 1.000 g durante 4 min. </li><li> Enquanto isso, adicionar 300 uL de água duplamente destilada para a CPG, de vórtice durante 20 segundos e centrifugar a 11000 xg durante 3 min. Transferir o sobrenadante para o dispositivo de centrifugação e centrifugar a 1000 x g durante 4 min. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. </li><li> Remover a água das soluções aquosas combinadas por centrifugação a 0,1 mbar e 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. Procedimento &quot;Clicando&quot; <ol><li> Adicionar 50 uL de água duplamente destilada, 25 jil de uma solução de ascorbato de sódio (0,4 M em água), 34 ul de tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 H em DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ul de azida (0,01 M em DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ul de uma tetraquis () cobre (I), solução de hexafluorofosfato de acetonitrilo (0,1 M em DMSO / tBuOH 3: 1) para a amostra de ADN modificado com alcino liofilizada. </li&gt; <li> Incubar a amostra a 60 ° C durante 1,5 h. </li><li> Arrefecer attemperatura ambiente. </li><li> Adicionar 150 ul de Na2EDTA (0,05 M em água) e 450 ul de acetato de sódio (0,3 M em água) à amostra de ADN e transferência para um tubo de 10 ml. </li><li> Adicionar 10 ml de etanol (100%) e manter a -32 ° C durante 16 horas. </li><li> embarcação Centrifugar durante 15 min a 1000 x g e remover o sobrenadante. </li><li> Lavar ADN-pelete com 2 ml de etanol frio (80%). </li><li> sedimento seco sob pressão reduzida. </li></ol> Purificação 4. HPLC Nota: Antes de separar as fitas de DNA se certificar de que o HPLC está funcionando corretamente, solvente suficiente disponível ea coluna está limpo. Lavar a coluna com tampão de concentração a partir de / acetonitrilo. <ol><li> Dissolve-se o ADN-pelete em bruto em 250 uL de água duplamente destilada e transferir para um frasco de HPLC. </li><li> Iniciar Executar HPLC de 45 min com um gradiente de 0% de acetonitrilo até 15% de acetonitrilo durante um corante e um gradi<html> ent de 0% de acetonitrilo a 17% de acetonitrilo para a tintura 2. Monitorar o funcionamento, verificando 260 nm (absorção DNA) e 459 nm (corante 1) ou 542 nm (corante 2). Recolhe-se as fracções que mostram absorção em ambos os canais de comprimento de onda. </li><li> Verificar as fracções recolhidas para a direita por massa assistida por matriz de ionização de dessorção por laser (MALDI) A espectrometria de massa utilizando uma matriz que consiste em 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) e diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Preparar a matriz através da mistura de 900 ul de uma solução saturada de 3-HPA em 1: 1-mistura de acetonitrilo e água com 100 ul de uma solução diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) em água. </li><li> Pipetar 1-2 ul da sonda de DNA no alvo e deixe secar ao ar. </li><li> Adicionar 0,2 mL da matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate à amostra e misturar até que cristaliza. </li><li> Execute espectrometria de massa MALDI. </li><li> Combinar as fracções de HPLC que exibem a massa direita. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. Determinação da Concentração Nota: A concentração é determinada através da medição da absorção a 260 nm usando um UV / Vis, com base nos coeficientes de extinção (ε 260) das bases de ADN e o corante. <ol><li> Dissolve-se o ADN em 100 - 200 ul de água duplamente destilada. </li><li> Aplicar 1 ul da solução de ADN no UV / VIS. </li><li> Medir a absorção a 260 nm. Repita três vezes. </li><li> Tomar o valor médio para o cálculo da concentração da solução. Para o cálculo dos coeficientes de extinção, utilizar ε 260nm das quatro bases naturais 12 e a 260 nm ε do Cu bloco de construção comprado (considerado como uridina natural) 12 para se obter a 260 nm ε de toda a cadeia de ADN. Para corante 1, o uso ε 260 nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 e para a tintura 2, o uso ε 260 nm = 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Calcula-se a concentração da solução seguinte lei de Lambert-Beers com base nos coeficientes de extinção e absorvências medidas. 13 </li></ol> 6. Preparação de amostras e espectroscopia <ol><li> Preparação de amostras de cadeia simples <ol><li> Preparar separadamente um ml de soluções 2,5 mM de cada um dos DNA1 modificado e DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de i, pH = 7. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de cadeia dupla <ol><li> Prepare 1 ml de uma solução contendo 2,5 | iM de DNA1 e 2,5 uM de DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de i, pH = 7 num vaso de reacção. </li><li> Fixar a tampa com uma tampa de segurança e de calor a 90 ° C durante 10 min. Em seguida, desligue aquecimento e deixar arrefecer até à RT O / N. </li></ol></li><li> espectroscopia de absorção Nota: Para determinar o comprimento de onda de excitação para a especificação de fluorescênciaOs espectros de absorção troscopy são registados. <ol><li> Medições de fita simples <ol><li> Grave uma medição em branco contendo apenas 200 mM de NaCl, NaP 50 mM i tampão, pH = 7. </li><li> Transferir a solução preparada de DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo e registar a absorção. Corrigir a medida contra os dados em branco. Determinar o valor máximo da absorção do corante. </li><li> Repita o procedimento para DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> espectroscopia de fluorescência <ol><li> Medições de fita simples <ol><li> Grave uma medição em branco contendo NaCl a 200 mM, NaP 50 mM i tampão, pH = 7; usando o comprimento de onda de excitação do corante 1. </li><li> Transferir a solução DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo. </li><li> Grave o espectro de fluorescência. </li></ol></li><li> Medição de fita dupla <ol><li> Transferir a solução de cadeia dupla numa cuvete de vidro de quartzo. </li&gt; <li> Grave o espectro de fluorescência usando o comprimento de onda de excitação do corante 1. </li></ol></li></ol></li><li> experiências de visualização Cuidado: protecção ocular adequada deve ser usado para evitar danos UV para os olhos! <ol><li> Para obter uma melhor compreensão do que os espectros registados estão mostrando, irradiam-se as tinas com lâmpadas UV portátil (Figura 5). Observe a mudança de cor de fluorescência a partir do individual para o DNA de cadeia dupla. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo mostra o procedimento completo para rotular DNA pós-sinteticamente através CuAAC por corantes fluorescentes modificados-azida. Isto inclui a síntese dos corantes e o ADN modificado com alcino, bem como o procedimento de marcação. A síntese dos corantes seguintes quatro passos. Todos os produtos podem ser obtidos por uma precipitação em vez simples, devido à sua carga positiva e sem cromatografia em coluna demorado é necessária. A introdução das funcionalidades azida antes dos passos de acoplamento centrais encurta a síntese dos corantes de quatro em vez de cinco passos de reacção consecutivos. A aplicação de 1,3-diiodopropane em vez de 3-iodopropanol para o passo de alquilação, a reacção Appel e as seguintes reacções Finkelstein para converter a função hidroxilo nas funcionalidades iodo foram evitados. Estas alterações em comparação com os procedimentos publicados nos permitem sintetizar os corantes em escalas maiores e períodos de tempo mais curtos. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Os corantes aplicados exibem uma excelente fotoestabilidade mas não a necessária estabilidade durante a síntese de DNA em fase sólida e processamento. Assim, a estratégia de rotulagem pós-sintético foi escolhido. Alternativamente, marcação com corantes tais preciosos durante a síntese de ADN representa de acoplamento e de desprotecção condições ultra-suaves (por exemplo, a desprotecção com carbonato de potássio). Isto representa uma alternativa significativamente mais caro e requer a síntese dos fosforamiditos modificado com corante correspondentes como blocos de construção de ADN ou a rotulagem sobre o suporte sólido (a-pérola). DNA1 é marcado por um corante, o corante dador e DNA2 por corante 2, o corante aceitador. Quando DNA1 e DNA2 são recozidos ambos os corantes entrar em estreita proximidade. Uma transferência eficiente de energia é observada quando corante 1 está animado. Em princípio, a interação excitônicas entre ambos os corantes podem interferir com uma transferência eficiente de energia uma vez que este processo requer a desacoplado e excitard corante 1 e desacoplado corante 2. Excitação dos corantes juntamente iniciaria diferentes vias fotofísicas. 14 Nossos estudos anteriores 9,15 revelou que o arranjo 3&#39;-5&#39;-diagonal aplicada de corantes fornece a base estrutural por apenas pequenas interações entre excitônicas os corantes e transferência de energia eficiente. A elevada eficiência da transferência de energia de fluorescência demonstrou permite leitura precisa in vitro e in vivo. Isto oferece uma vasta gama de aplicações, incluindo a visualização de hibridação de ADN em beacons moleculares, a ligação de moléculas alvo em aptâmeros de ácidos nucleicos com base, bem como a visualização da integridade do pequeno ARN interferente (siRNA) no interior das células. A principal limitação é a exigência para rotular as duas cadeias de ADN. No futuro pretendemos focar o nosso trabalho no desenvolvimento de sondas de oligonucleotídeos duplamente marcada rolamento ambos os corantes em um fio.

A imagem molecular representa uma técnica fundamental para a compreensão dos processos biológicos dentro de células vivas. 1-3 O desenvolvimento de sondas fluorescentes de ácidos nucleicos com base para tais aplicações químico-biológica tornou-se um campo de pesquisa em expansão. Estas sondas fluorescentes precisam atender a alguns requisitos para se tornar as ferramentas apropriadas para imagens de células. Em primeiro lugar, os corantes aplicados devem apresentam uma fluorescência com elevados rendimentos quânticos, os desvios grandes Stokes &quot;e, mais importante ainda, elevados photostabilities para permitir a longo prazo in vivo de imagens. E em segundo lugar, devem mostrar uma leitura de fluorescência fiável. Convencional cromóforo-quencher-sistemas são baseados na leitura de uma única cor de fluorescência por mudanças simples em intensidades de fluorescência. 4 Esta abordagem assume o risco de resultados falsos positivos ou falsos negativos devido a autofluorescência de componentes intracelulares ou baixos rácios de sinal-ruído devido à têmpera indesejada por outro cOMcomponentes. 4 Recentemente, relatou-se no conceito de &quot;semáforos de ADN&quot; que mostram leituras de cor de fluorescência dupla usando dois cromóforos diferentes. 5-6 O conceito baseia-se na transferência de energia (ET) a partir do corante dador do corante aceitador à qual muda a fluorescência cor (ver Figura 1). Isto permite uma leitura mais fiável e, assim, fornece uma ferramenta poderosa para sondas de imagem fluorescentes. Rotulagem dos oligonucleótidos com corantes fluorescentes pode ser conseguida por duas abordagens diferentes. Os corantes podem ser incorporados durante a síntese química de ADN sobre uma fase sólida, utilizando blocos de construção de fosforamidite correspondentemente modificados. 7 Este método é limitado aos corantes que sejam estáveis ​​sob as condições de desprotecção e de fosforamidite padrão. Como alternativa, as metodologias de modificação pós-sintética foram estabelecidas na química de oligonucleótidos. Aqui, nós demonstramos a síntese de um dos nossos novos fotosenergia tabela de pares de transferência de 8,9 e a rotulagem de pós-sintética de DNA usando catalisada por cobre 1,3-cicloadição entre azidas e alcinos (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

Neste protocolo, demonstramos um método para a síntese de 2&#39;-alcino modificado cadeias de ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntese em fase sólida automatizados usando a química fosforamidite padrão. Oligonucleotídeos são pós-sinteticamente marcado por dois novos corantes cianina fotoestáveis ​​usando click-química catalisada por cobre. A síntese de ambos os corantes dador e aceitador é descrita e é realizado em três etapas consecutivas. Com o ADN como a arquitectura envolvente, estes dois corantes submetidos a uma transferência de energia quando eles são colocados em estreita proximidade por hibridação. Portanto, emparelhamento de duas cadeias de ADN de cadeia simples é visualizada por uma mudança de cor de fluorescência. Esta mudança de cor é caracterizado por espectroscopia de fluorescência, mas pode também ser directamente observada por utilização de uma lâmpada ultravioleta de mão (UV). O conceito de uma leitura de cor de fluorescência dupla faz com que essas sondas de oligonucleotídeos excelentes ferramentas para imagiologia molecular, especialmente quando o pho descritacorantes tostable são utilizados. Deste modo, as sondas fotodegradação de imagiologia é prevenida, e os processos biológicos pode ser observada em tempo real durante um período de tempo mais longo.

Absorção e espectros de fluorescência do ADN de cadeia dupla e são registados como mostrado na Figura 4. O espectro de absorção gravado (Figura 4 à direita) mostra a absorção maxima λ max a 465 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1) e 546 nm para DNA2 de cadeia simples (corante 2). O DNA1_2 recozido (corante corante 1 &amp; 2) apresenta máximos a 469 nm e ambos 567 nm. Ambos máximos de absorção mostram um deslocamento batocrómico, 4 nm para o corante de 1 e 21 nm para o corante de 2. Estas pequenas alterações espectroscópicas são o resultado de interacções entre as excitônicas corantes dentro da arquitectura de dupla hélice de ADN. Os espectros de fluorescência correspondente (Figura 4 esquerda) maxima exposição λ max, a 537 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1, excitação a 435 nm), a 607 nm para singleDNA2 -cordas (corante 2, excitação a 535 nm) e em 615 nm para DNA1_2 recozido (dye 1 &amp; tingir 2, excitação a 435 nm). DNA1_2 mostra apenas o máximo de emissão de corante 2 embora corante 1 é selectivamente animado que evidencia que a transferência de energia ocorre de forma eficiente a partir de corante 1 para tingir 2. Isto dá uma taxa de contraste de emissão de 01:57. A diferença entre a cadeia simples e dupla é evidente através da comparação da emissão de cor na cuvete durante a excitação com uma lâmpada UV padrão como mostrado na Figura 5. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig1.jpg" /> Figura 1. conceito básico de uma transferência de energia no DNA. A cadeia de DNA doador modificado (verde) mostra a fluorescência a 535 nm após irradiação a 435 nm. Se ele é hibridado com o contador de cadeia modificada-aceitador (vermelho) do que resulta de cadeia dupla shows somente a fluorescência vermelha do corante aceitador a 610 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig2.jpg" /> Figura 2. Síntese visão geral de corante um corante e 2. A síntese dos dois corantes cianina 1 (A) e 2 (B) é levada a cabo em três etapas consecutivas. 9 (a) a) 1,3-diiodopropane, CH3 NC, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) de K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 44%. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig3.jpg" /> Figura 3. Estrutura do bloco de construção de Cu 9, corantes 1 e 2 e as sequências de DNA1 e DNA2. Os corantes 1 e 2 estão ligados a posição 2 &#39;da ribose por um ligante triazol dentro das sequências apresentadas e DNA2 de DNA1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig4.jpg" /> Figura 4. Fluorescência de cadeias de ADN cadeia simples e dupla (esquerda) e absorção de cadeias de ADN cadeia simples e dupla (à direita). espectros de emissão de DNA1 (preto) animado em 464 nm, DNA2 (vermelho), animado a 535 nm e 435 nm (rosa ), e híbridos DNA1_DNA2 (azul), excitado a 435 nm são mostradas. O espectro de absorção do DNA1 de cadeia simples (preto), DNA2 (vermelho), eo hibridizada DNA1_DNA2 fita dupla (azul) são mostrados no show do lado direito. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig5.jpg" /> Figura 5. cor Emissão do DNA de cadeia simples com corante doador (esquerda) e DNA de cadeia dupla com doadores e corante aceitador (à direita) durante a excitação por uma lâmpada UV. A imagem do cadinho contendo o único DNA1 encalhado (LEFt lado) mostra fluorescência verde brilhante, ea imagem do DNA1_DNA2 cadeia dupla (lado direito) mostra fluorescência vermelha durante a excitação por uma lâmpada UV handheld a 366 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

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11.1K visualizações.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Bioquímica

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologia

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Bioengenharia

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

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