Name: stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo at JoVE.com

The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Experimentos cumpram a regulamentação nacional e comunitária relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e com os princípios internacionalmente consagrados de substituição, redução e aperfeiçoamento. 1. Plano-montagem de Xenopus laevis girinos Tubo Neural Anterior Depois de Todo-mount Hibridização In Situ <ol><li> Obter X. laevis embriões de acordo com os procedimentos padrão 4 e idade eles até que atinjam neurula fase 26 e mais velhos (de acordo com Nieuwkoop e Faber mesa desenvolvimental 17. </li><li> Fix X. laevis girinos, incubando-as numa solução de paraformaldeído a 4% (PFA). Rocha e rodar os embriões em um frasco de vidro de 2 ml, de 1 a 1,5 horas à temperatura ambiente para a fase 26, a fase 38 embriões, 2 h à TA durante embriões em fases posteriores. CUIDADO: PFA é tóxico por contato e um cancerígeno. Deve ser manipulada sob um capuz. NOTA: Uma X. laevis ninhada égeralmente fixa em um frasco de vidro de 2 ml de um frasco de vidro, mas maior pode ser usado. </li><li> Lavar os embriões no mesmo frasco utilizando 1x PBS com 0,1% de Tween (PBT), 3 min à temperatura ambiente, duas vezes. NOTA: A menos que de outra forma especificado o PBS é utilizada com ou sem cálcio e magnésio. </li><li> Desidratar os embriões em 100% de metanol (MeOH) durante pelo menos 12 horas à temperatura ambiente no mesmo frasco. Alterar a 100% de MeOH, pelo menos, duas vezes sob o capô utilizando uma micropipeta de plástico. NOTA: O MeOH ficar ligeiramente amarelada como lipídios dissolvidos nela. Cuidado o MeOH é tóxico por inalação e deve ser manipulado sob um capuz. </li><li> Reidratar os embriões utilizando o mesmo frasco através de uma série gradual de banhos de MeOH: 75% de MeOH em PBS, 50% de MeOH em PBS, 25% de MeOH em PBS, PBS, duas vezes, a cada banho de 5-10 min à temperatura ambiente. As soluções de MeOH são alteradas sob o capô utilizando uma micropipeta de plástico. </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir o embrião para ser dissecado em uma placa de Petri 60 milímetros cheio até o topo com PBT. Usando dois pinça fina cuidadosremover completamente os olhos através da inserção de uma pinça fina entre os olhos e do tubo neural, ao nível da haste óptica. Retire os olhos do tubo neural. Introduzir cuidadosamente a pinça abaixo do ectoderma do tubo neural. Com cuidado, retire o ectoderma a partir de trás da cabeça e descartá-lo. </li><li> Executar uma ISH dupla ou simples usando digoxigenina marcado ou sondas marcadas com fluoresceína como previamente descrito 18,19. </li><li> Após a ISH transferir os embriões numa nova placa de Petri 60 mm cheia até ao topo com PBT utilizando uma pipeta de plástico. </li><li> Usando fórceps finos cuidadosamente separar o tubo neural do resto do embrião. Nesta fase, o tubo neural anterior separa do tubo neural posterior. Retirar cuidadosamente restantes partes do ectoderma do tubo neural, o notocórdio que é frouxamente ligado abaixo do tubo neural, as vesículas óticas e partes restantes da mesoderme. Certifique-se de que o tubo neural é desprovido de quaisquer apêndicesnesse estágio. NOTA: Para evitar danos no tubo neural executar todas as transferências de tubo / embrião neural com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta, se necessário, com um corte de ponta no seu final. O diâmetro da extremidade da ponta é ajustado para o tamanho do tubo neural. </li><li> Transferir o tubo neural dissecados (ver nota passo 1.9) em um tubo de 1,5 ml cheio com 50% de glicerol em PBS diluídas. Aguardar até que os tubos neurais tenham caído para a parte inferior da solução de glicerol, geralmente O / N a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de glicerol a 50% / PBS utilizando uma micropipeta P1000 e adicionar no mesmo tubo 1,5 ml de uma solução 90% glicerol / PBS utilizando uma micropipeta P1000. Aguardar até que os tubos neurais cair para o fundo da solução de glicerol a 90% / PBS, geralmente O / N a 4 ° C. NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, utilizar 90% de glicerol / PBS mais antibióticos para impedir o desenvolvimento bacteriano. </li><li> Transferir os tubos neurais em uma placa de vidro, ou uma lâmina de microscópio com uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Disseita dos tubos neurais ao longo da dorsal e ventral midlines utilizando agulhas de tungstênio. Durante este passo, os tubos neurais são mantidas em glicerol a 90% / PBS. </li><li> Montar os dois lados do tubo neural em 90% de glicerol / PBS utilizando anéis de reforço cobertos com uma lamela de vidro. </li><li> Corrigir as lamelas com verniz e manter a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap animal explantes de indução usando esferas de resina de troca aniónica <ol><li> Transferir 100 ul de pérolas de resina de permuta aniónica para um tubo de 2 mL, utilizando uma micropipeta P1000. Lavar os grânulos, pelo menos, cinco vezes consecutivas com água destilada estéril. Permitir que as esferas sedimentem no fundo do tubo e substituir a água destilada estéril usando uma micropipeta P1000. Não toque as contas. </li><li> Deixar os grânulos embeber O / N num tubo de 2 mL cheias com água destilada estéril com Albumina de Soro Bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Duas horas antes de coletar o ACs, lugar metade das pérolas em um novo 1,5 mltubo utilizando uma micropipeta P1000. Substituir a água destilada estéril com 500 ul do meio que contém a molécula a ser testada quanto à sua potencial indutivo, ou que se sabe induzir um destino específico. Mantenha a outra metade das pérolas, à medida que vai ser utilizado como um controlo negativo. </li><li> Incubar as pérolas a 4 ° C durante pelo menos 2 horas. </li><li> Realizar todas as etapas subseqüentes sob o microscópio estereoscópico e executar todas as transferências AC com uma micropipeta. </li><li> Transferir blástula ou gástrula embriões muito precoces em PBS com cálcio e magnésio complementada com 0,2% de BSA utilizando uma pipeta de transferência de plástico. NOTA: Os embriões em desenvolvimento a 12 ° C blástula e gástrula alcance estágios em 20 a 24 horas. </li><li> Remover membrana vitelina do embrião usando uma pinça, como previamente descrito 20. Corrigir o embrião com um fórceps. Comprima a membrana vitelina, com o lado das outras fórceps. Segurando a membrana, lentamente retire-a do embrião. Execute este procedimento no ventral (vegetal) lado do embrião. Não danifique o lado animal do embrião. </li><li> Isolar pequenas ACs como descrito anteriormente 21. O pólo animal é parte pigmentada do embrião. Usando uma pinça fina cortar um pequeno quadrado de tecido para fora do pólo animal. O tecido AC contém apenas as células ectodérmicas. Assegure-se que o tecido é de espessura uniforme. Se não, remover a AC a partir da análise. </li><li> Coloque cada AC em um Terasaki placas com múltiplas cavidades em 0,5x modificação de Barth Saline (MBS) 4. Coloque o AC no poço com seu lado animal pigmentada para baixo, em contacto com o fundo redondo do poço. NOTA: pipetas de revestimento com uma solução de BSA a 0,1% evita a adesão de pequenos pedaços de tecido adesivo para o plástico. </li><li> Coloque uma pérola em cada tampa usando uma micropipeta P20. Se necessário, utilizar uma pinça para colocar cuidadosamente o grânulo no centro da tampa. NOTA: Quando embebido em um meio condicionado, as contas são coloridos em rosa. Selecione o maior número de cogrânulos Lored. </li><li> Incubar a temperatura ambiente (18 a 22 ° C) durante 6 horas sem mover a placa com múltiplas cavidades Terasaki. O talão de varas para o AC em menos de 2 horas. </li><li> Colocar a placa com múltiplas cavidades Terasaki no topo de papéis embebido em água. Cobrir a placa com um recipiente de plástico. NOTA: Este &#39;câmara de umidade&#39; impede a evaporação prematura dos poços. </li><li> Cultura do ACs em 0.5x MBS ou 3/4 NAM (veja o passo 4.1) na câmara de humidade a 15-20 ° C até que os embriões irmãos atingiram o estágio correto para testar o efeito do seu fator. </li><li> Fixar o ACs durante 1 hora em recém-preparados PFA 4%. Desidratar o ACS 100% de MeOH como descrito anteriormente (Passo 1.4). </li></ol> 3. Cap animal dissociação celular e reagregação Antes miocárdio em Xenopus laevis nêurula <ol><li> Revestimento pratos de Petri (60 mm) ou poços de placas de 12 com 3% de agarose em água estéril ou em PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar agarose suficiente para cobrir a bottom da placa de Petri ou do poço. Pré-aquecer as placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, as placas armazenadas para alguns dias a 4 ° C para evitar a desidratação. </li><li> Prepare isento de cálcio salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, KCl 0,7 mM, HEPES 4,6, 0,1% de ASB (A-7888 Sigma, pH 7,6)) e solução salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, KCl 0,7 mM, CaCl 0,9 mM, 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. NOTA: a solução de CaCl 2 não pode ser autoclavado. </li><li> Encha o bem até o topo com solução salina isenta de cálcio de Holtfreter revestidas de agarose. </li><li> Prepare blástula ou gástrula embriões muito precoces para isolar os seus ACs como descrito anteriormente (passos 2.5 a 2.7). </li><li> Isolar pelo menos 15 ou até 30, 21 ACs pequena. Usando uma pinça fina cortar um pequeno quadrado de tecido para fora do pólo animal. O tecido AC contém apenas células ectodérmicas e é, portanto, de espessura uniforme. Se não, remover a AC a partir da análise. NOTA: O pólo animal é o Embryparte pigmentada de o. </li><li> Transfira as ACs em uma agarose-revestido bem cheio até o topo com livre-Calcium salina de Holtfreter. Coloque o ACs com seu lado pigmentado virado para cima. NOTA: O processo de dissociação começa rapidamente nos livre de cálcio salina de Holtfreter. </li><li> Aguarde alguns minutos para que as células começam dissociar. Observar este através da desagregação dos tecidos. Utilizando finos fórceps, separar a camada pigmentada do resto da CA e descartá-las com uma micropipeta P20. Processo de dissociação de células indica completa separação das células a partir de uma outra. NOTA: Uma ou duas camadas pigmentadas podem ser deixados dentro do explante re-agregadas para ajudar a visualização durante a enxertia. </li><li> Centre as células utilizando movimentos circulares do prato. Usando uma micropipeta P1000 remova cuidadosamente tanto meio quanto possível. Tenha cuidado para não tocar nas células. </li><li> Adicionar 1 ml de solução salina de Holtfreter com o cálcio para o poço. Transfira as ACs dissociadaspara um tubo de 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubos não pode ser utilizado devido ao seu fundo redondo. </li><li> Agregar as células por centrifugação, 5 min a uma velocidade máxima de 2.000 rpm numa centrífuga de bancada para (500 xg). Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta P1000. </li><li> Adicionar às células dissociadas 20 ul de solução salina de Holtfreter com cálcio (60 mM NaCl, KCl 0,7 mM, CaCl2 0,9 mM, HEPES 4,6 mM, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5. </li><li> Manter o ACs dissociado, 3 a 6 horas à temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: Este é tempo necessário para que as células re-agregado. A re-agregação é visível como as células formam uma pequena bola na parte inferior do tubo. </li><li> Separe o explante cuidadosamente a partir do fundo do tubo por adição de 1 ml de 0.5x ou MBS de 1 ml de 3/4 NAM (ver passo 4.1). Transferir o explante em uma placa não revestida usando uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Encenar os explantes usando seus irmãos de controle. Para longo prazo antibióticos de uso cultura: kanamyCIN (50 ug / ml), ampicilina (50 ug / ml) e gentamicina (50 ug / mL). </li></ol> 4. Alongamento das Caps animal explantes na Placa Neural de X. laevis Embryo <ol><li> Prepare 3/4 NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 ug / ml de gentamicina). Não mantenha por mais de uma semana para a dissecção e armazenar a 4 ° C. NAM mais antigas podem ser utilizados para a preparação de pratos revestidos de dissecação-agarose (abaixo). </li><li> Pratos de petri Brasão (60 mm) com 3% de agarose em 3/4 NAM em que pequenos buracos foram feitos usando um molde de silicone, ou a tampa de uma raquete de tênis de mesa. NOTA: A agarose cobre o fundo do prato de petri. Deixe algum espaço para que o prato de petri para preencher com 3/4 NAM. Alternativamente fazer pratos de dissecação com massa de modelar não-secagem. Dentro da argila, espremer os embriões ligeiramente durante o procedimento de dissecção. Cavar buracos pequenos noagarose utilizando fórceps arredondadas Esta &#39;prato de dissecação&#39; ajuda a manter os embriões durante o procedimento de dissecção. </li><li> Coletar ferramentas de dissecação: pipetas de transferência de plástico, uma &quot;faca de sobrancelha &#39;(feito com o cabelo da sobrancelha embebidos em parafina na ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro) 22, duas pinças de dissecação finas, P1000 micropipeta e dicas, um stereosmicroscope com ampliação 8-40X, uma fonte de luz brilhante com guias de fibra óptica. Mantenha todas as ferramentas de dissecação limpa; após cada experimento, lave-os com água destilada duas vezes, uma vez com 100% de etanol e deixe secar. Armazene longe de poeira e, se necessário autoclave as ferramentas de metal de dissecação. </li><li> Deixe o re-agregadas ACs (protocolo 3), e seus irmãos dissociados e X. embriões laevis desenvolver até atingirem fase 13 (neurula) de acordo com Nieuwkoop e Faber mesa desenvolvimental 17. Para o transplante dentro do palco placa neural 13 para estágio 15 embriões são usados. </li><li> Realizar todosetapas subseqüentes sob o microscópio estereoscópico. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de plástico, transferir os embriões em PBS com cálcio e magnésio complementada com 0,2% de BSA. Remover membrana vitelina do embrião como previamente descrito 20. Corrigir o embrião com um fórceps. Comprima a membrana vitelina, com o lado das outras fórceps. Segurando a membrana firmemente, lentamente retire-a do embrião. NOTA: Faça este procedimento no (vegetal) lado ventral do embrião. Não danificar os embriões placa neural. Se os embriões foram danificados durante o passo de remoção da membrana vitelina, os embriões transferir numa placa de Petri 60 mm contendo 3/4 NAM usando uma pipeta de transferência de plástico e esperar 15 minutos, um tempo suficiente para que o processo de cura ocorra. </li><li> Preencha o prato dissecção até o topo com fresco 3/4 NAM. </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir os embriões sem a sua membrana vitelina no prato dissecção. Coloque os embriões lado dorsal para dentroos poços. Durante o processo de transferência não permitem o embrião para entrar em contacto com a interface ar-líquido desde X. laevis são lisadas pela tensão superficial. </li><li> Transferir o explante CA para ser enxertado na placa de dissecação, utilizando uma pipeta de transferência de plástico ou uma micropipeta P1000. Uma vez que a pipeta está dentro do líquido, permitir que os explantes a afundar lentamente para baixo pela gravidade, ou empurrar muito suavemente. </li><li> Manter os embriões com uma pinça arredondados. Com a faca sobrancelha fazer uma incisão na placa neural onde você pretende enxertar pedaço do seu explante. NOTA: Na etapa 14 a flexão anterior da placa neural pode ser usado como um ponto de referência, ele marca o território diencephalon (Figura 4). </li><li> Corte um pequeno pedaço de neuroepithelium, usando uma pinça arredondadas e um knive sobrancelha. Corte um pequeno pedaço do explante com a faca sobrancelha. NOTA: O pedaço de explante deve ser aproximadamente o mesmo tamanho e forma como neuroepithelium área de ablação. </li&gt; <li> Coloque o pedaço de explante na incisão neuroepithelium usando a faca sobrancelha e uma pinça fina. Assegure-se que o explante atribui-se rapidamente para o embrião. </li><li> Alternativamente coloque um pedaço de lamela de vidro para o embrião enxertada para manter o enxerto no local. Para fazer isso, cortar uma lamela de vidro fino em pedaços muito pequenos usando uma pinça grosseiras. Assegure-se que o tamanho é de aproximadamente 1,5 mm2. Mergulhe as peças em uma placa de Petri contendo 3/4 NAM ou PBS usando uma pinça. Escolha um pedaço de vidro maior do que o embrião para evitar danificá-lo. O embrião vai ser um pouco achatado. </li><li> Aguarde pelo menos 30 minutos sem se mover, ou só se movem a placa de dissecação suavemente. Deixe o embrião recuperar durante 30 min a 2 h e remover suavemente a lamela se necessário. Pipetar cuidadosamente os embriões enxertados em um prato limpo preenchido com 3/4 NAM, usando a pipeta de transferência de plástico. NOTA: Transplantado embriões tendem a desenvolver bactérias ou contaminação fúngica. Para a longo prazo cultura utilizar antibióticos: canamicina (50 ug / ml), ampicilina (50 ug / ml) e gentamicina (50 ug / mL). </li></ol>

<ol>
	<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IIB,+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+(CNS)+of+the+amphibians+and+birds+(English).">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+induction+process;+its+morphogenetic+aspects.">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li><li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction.">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).</li><li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos.">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beads+on+the+run:+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays.">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog.">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li><li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm.">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li><li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus.">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li><li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphogen+gradient+of+Wnt/beta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus.">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li><li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4.">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li><li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development.">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li><li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development.">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos.">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis.">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain.">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+neural+plate:+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3.">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li><li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+early+Xenopus+embryo.">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li><li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Desenvolvimento neural é orquestrado por uma complexa interação entre os programas de desenvolvimento celulares e sinais dos tecidos circundantes (revisto em 3,31,32). Descrevemos aqui um conjunto de protocolos que podem ser utilizados em X. laevis embriões para explorar extrínsecos e intrínsecos factores envolvidos na determinação do destino neural e morfogénese neuronal in vitro e in vivo. Estes protocolos podem ser utilizados como tal em X. embriões <e...

O sistema nervoso de vertebrados emerge da placa neural como uma camada homogénea de células neuroepiteliais. Compreender como os programas de desenvolvimento são induzidas, codificado e estabelecido durante regionalização da placa neural é, actualmente, um dos principais objetivos em biologia do desenvolvimento. Em comparação com outros sistemas, o embrião Xenopus experimentalmente receptivo é um modelo de escolha para analisar etapas iniciais de 1,2 desenvolvimento neural. É fácil de obter um grande número de embriões, e desenvolvimento externo dá acesso aos primeiros passos de neurulação 3. Muitas ferramentas estão disponíveis para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) o desenvolvimento embrionário. A micro-injecção de ARNm ou morpholinos (MO), incluindo OMs indutíveis, em conjunto com as ferramentas bioquímicas e farmacológicas, permite que o ganho de função (GOF) e perda de função (LOF) e alteração específica de vias de sinalização 4,5 controlada. O blastocoel ectoderme telhado, localizada em torno do pólo do animal de uma blástula, ou um gástrula embrião precoce, e referido como o &quot;tampão animal &#39;(AC), é uma fonte de células pluripotentes, que pode ser programado por manipulação da expressão do gene antes da explantes preparação. Neste manuscrito são protocolos detalhados para usar X. explantes laevis AC para testar in vitro e in vivo em mecanismos moleculares e processos celulares desenvolvimento neural subjacente. Uma técnica é apresentada, que permite a observação fina de padrões de expressão de genes em um tubo de girino Xenopus neural, um passo preliminar na identificação de sinais de determinação de destino. Considerando que a observação dos tecidos lisos-montado é comumente utilizada no estudo de embriões de galinha 6, que não foi correctamente descrita em Xenopus. Manipulação da expressão do gene através da injeção de mRNA sintético ou MO para os blastômeros de 2 ou 4 embriões em estágio de célula permite a programação de ACexplantes 4. Por exemplo inibição da proteína morfogenética óssea (BMP) via pela expressão do anti-BMP fator Noggin, dá uma identidade neural de células Cl 3. O protocolo é detalhado para a realização de exposição local e controlada no tempo de explantes AC aos sinais extrínsecos através de contacto directo com uma esfera de resina de permuta aniónica. Finalmente uma técnica está descrito para testes do desenvolvimento dos progenitores neurais in vivo por transplantação de explantes preparados a partir de células mistas distintas programado dissociados e re-associadas. O embrião rã é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento neural vertebrado cedo. Combinando a manipulação da expressão génica explantar culturas in vitro fornece informações importantes no estudo do neuroepitélio regionalização, proliferação, e morfogénese 7-12. A programação de explantes AC permitido o desenvolvimento de um coração funcional ex vivo 13,14. O usoexplante de enxerto 15 levou à identificação do comutador de transcrição mínima induzir o programa de diferenciação crista neural 16. O intrathalamica limitans Zona (ZLI) é um centro de sinalização que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar o crescimento e regionalização da parte frontal do cérebro caudal. Quando continuamente exposto a Shh, as células gliais coexpressï¿½ os genes do factor de três de transcrição - barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) e iroquois-3 (irx3) - adquirir duas características do compartimento de ZLI: a competência para expressar shh, ea capacidade de segregar a partir de células placa neural anterior. Como um sistema modelo, a indução de um destino ZLI em células neuroepiteliais será apresentado 8. Estes protocolos visam fornecer e ferramentas eficientes simples e baratos para os biólogos do desenvolvimento e outros pesquisadores a explorar o mec fundamentaishanisms de comportamentos de células neurais chave. Estes protocolos são muito versáteis e permitem a investigação de uma vasta gama de sinais neurais de determinação extrínsecos e intrínsecos. Ele permite a longo prazo na análise in vivo de compromisso linhagem neural, interações indutivas e comportamentos celulares.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;20909.290</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>anion exchange resin beads</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>For culture of animal cappH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&amp;nbsp;</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&amp;nbsp;for bead preparation</td></tr></tbody></table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Com base em considerações morfológicas em espécies diferentes, manipulações embriológicos, e o padrão de expressão de genes reguladores, um modelo conceptual que prende a placa neural é dividida em segmentos longitudinais e transversais que definem uma grade de desenvolvimento gerar campos histogênica distintas. Na placa neural, o primórdio do cérebro anterior, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinal são já estabelecida ao longo do eixo ântero-posterior (AP), durante...

Watch this Scientific Journal Video about Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K visualizações.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

Vídeo: Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociência

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Geração de Explantes de Blastoderm ingênuos de Embriões de Zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Stem Cell-like

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado

Clonagem Funcional Utilizando um

Neurais culturas de explante de

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

Geração de Explantes de Blastoderm ingênuos de Embriões de Zebrafish

Avaliando Neurogênese Primária em

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Dissecção