Name: studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

A ética regionais comitê regional de experimentos com animais aprovou este método, de acordo com atenção nacional e internacional de animais e uso de diretrizes de pesquisa experimentais. Coleção 1. Amostra <ol><li> Armazenamento das amostras <ol><li> Colher todas as amostras e imediatamente armazenar a - 20 ° C ou em gelo até o armazenamento do congelador para evitar a deterioração. Coloque fosfato estéril tamponado salino (PBS) em gelo para melhorar lavagens bronco-alveolar desempenho (BAL). </li></ol></li><li> Cirurgia <ol><li> Esterilizar todos os equipamentos cirúrgico usando um autoclave. NOTA: Se possível, recomenda-se usar dois diferentes conjuntos de instrumentos para as etapas abdominal e torácica para evitar a contaminação cruzada. Equipamento de dissecção necessárias é detalhado na Figura 4A </li></ol></li></ol> 2. Mice, bacterianas e de levedura Estirpes <ol><li> Os ratos domésticos em conformidade com a utilização de animais em locais reDirectrizes do comitê de pesquisa em um rack ventilado sem exceder 5 ratos por gaiola, com comida e água ad lib, em uma instalação de alojamento nível de biossegurança 2 devido ao uso de Nível de Biossegurança 2 microrganismos: P. aeruginosa e C. albicans. </li><li> Manter as estirpes bacterianas a -80 ° C em 40% de meio de glicerol. <ol><li> Adicionar bactérias diretamente do estoque congelado em tubo de cultura contendo 3 ml de caldo de Luria estéril-Bertani usando um loop de inoculação de 10 ul. Deixar O / N a 37 ° C com agitação orbital (400 rpm) no dia antes da instilação. </li><li> Colheita bactérias por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante para uma eliminação de resíduos perigosos fechado apropriado. Observar aderente sedimento branco no fundo do tubo de cultura. </li><li> Lavar e suspender o sedimento utilizando 5 ml de PBS. </li><li> Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem. </li><li> Ressuspender as bactérias sedimentadas utilizando 1 mL de PBSe breve vórtice. </li><li> Determinar a densidade de inoculo usando densitómetro óptica a 600 nm utilizando um medidor de densidade óptica. Uma densidade de 0,9 corresponde a 10 9 CFU / ml para PAO1, dilui-se em conformidade. NOTA: Este resultado tem que ser obtida para cada estirpe utilizada por determinação da densidade de diluições sucessivas de um inoculo calibrado. </li><li> Verifique se o inóculo por diluições logarítmicas em série e placa 100 ul de cada diluição em agar roxo bromocresol (BCP) placas e cultura O / N. Administrar cada ratinho por via intranasal a 50 ul de solução contendo 1 x 10 8 para 2 x10 8 CFU por ml (5 x 10 6 para 1 x 10 7 CFU por ratinho). </li></ol></li><li> Use C. albicans SC5314 como uma estirpe de referência. Conserve a estirpe em 40% de meio de glicerol a -80 ° C. <ol><li> Suplemento caldo de levedura-peptona-Dextrose com 0,015% de amicacina para evitar a contaminação bacteriana e facilitar ainda mais a contagem. </li><li> Adicione o fermento usando 10 &amp;# 181; l laço inoculação em caldo preparado YPD-suplementado com amicacina O / N a 37 ° C. </li><li> Levedura colheita por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante em uma eliminação de resíduos bioharzard apropriado. Branco aderente sedimento deve ser observado na parte inferior do tubo de cultura. </li><li> Lave e suspender as bactérias peletizadas usando 5 ml de PBS e breve vórtice. </li><li> Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento utilizando 1 mL de PBS e breve vórtice. </li><li> Determinar o tamanho do inoculo pela contagem num hematocytometer Mallassez usando um microscópio padrão em ampliação de 40x. NOTA: A concentração (em UFC / ml) é obtido usando a seguinte fórmula: (número de levedura 5 x 10) / (número de rectângulos de grelha contados no hematocytometer Mallassez). </li><li> Verifique por diluição em série logarítmica a 10 -5 e -6 10 para confirmar que a solução contém 2 x 10 6 CFU / mL. </li><li> Placa em placas de YPD-agar suplementado com 0,015% de amicacina. </li></ol></li></ol> 3. Airways Colonização por C. albicans NOTA: Depois de adaptação ambiental, os ratos são pesados ​​duas vezes por dia. <ol><li> Sob um exaustor, para depósito de 500 mL de sevoflurano em um 4 cm x 4 cm de gaze (técnica-drop aberto) 14. <ol><li> Colocar imediatamente a gaze sobre o chão de uma câmara de aproximadamente 750 ml de indução. Imediatamente coloque uma plataforma elevada de malha acima da gaze para evitar o contato direto entre o animal ea gaze. </li><li> Feche tampa hermética e esperar 1-2 min para permitir a difusão do sevoflurano na câmara. </li><li> Transferir o mouse de gaiola em malha plataforma e feche a tampa. Anestesia leve com respiração espontânea conservado deve ser alcançado em 30 a 45 seg. </li><li> Monitor para hipotonia, observando a perda do reflexo de endireitamento altura em que o rato pode ser removido from da caixa e incutiu. </li></ol></li><li> Instilação intranasal (pode ser realizada em 10 segundos por um operador treinado). <ol><li> Segure o mouse com uma mão situado em sua parte traseira em posição vertical (Figura 4B). </li><li> Usando o dedo indicador, o apoio de cabeça e usar o polegar para manter a mandíbula fechada para evitar a expectoração (Figura 4C). </li><li> Conforme descrito no passo 2.3.8, garantir que o preparado C. albicans solução contém 2 x10 6 CFU por ml durante 50 ul incutidos volume. NOTA: O segundo ponto crítico é o volume instilado. Um volume menor do que 50 ul poderia resultar em uma colonização insuficiente ou instilação não homogêneo de vias aéreas, um volume maior pode induzir afogamento / asfixia e morte. </li><li> Incutir o mouse intra-nasal, abordando a pipeta para as narinas. </li><li> Pipetar uma gota de 50 ul a formação de uma bolha contendo a solução sobre as narinas, posteriormente inalada pelo spontaneously do mouse respiração. </li><li> Coloque o rato em uma área de recuperação (por exemplo, uma gaiola grande nu bem arejada com uma lâmpada de aquecimento em cima). Os ratos devem ser monitorizados até despertar completo. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e reflexo de endireitamento. Neste ponto, o rato pode ser retornado para uma gaiola de habitação normal. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa induzida por infecção pulmonar aguda NOTA: Os ratos são pesados ​​durante os quatro dias seguintes. Normalmente, os ratos ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas mediada albicans (Figura 2A). <ol><li> Preparar a suspensão contendo P. aeruginosa o dia da instilação depois de O crescimento / N (ponto 2.2). </li><li> Anestesiar brevemente utilizando inalado sevoflurano como descrito acima (seção 3.1). NOTA: Para executar infecção pulmonar aguda, recomenda carga bacteriana são sugeridas emTabela 1. </li><li> Incutir o rato como descrito acima (seção 3.2), com especial atenção à recuperação pós-instilação. </li></ol> 5. Meça do Índice de Lesão Pulmonar <ol><li> Prepara-se uma solução contendo albumina marcado com FITC. Injectar a solução 2 h antes de eutanásia animal. <ol><li> Pesar 0,2 mg de albumina-FITC com o equipamento apropriado. </li><li> Adicionar 0,2 mg em 1 ml de PBS. Vortex brevemente. Se não for utilizado imediatamente, colocar a solução em papel alumínio para evitar a exposição à luz ambiente. </li><li> Injectar intraperitonealmente 200 ul de solução de albumina marcada com FITC a cada rato. </li></ol></li><li> Eutanásia <ol><li> Pesa-se a ratinhos para o último os dados de peso. </li><li> Euthanize um único rato de acordo com o uso local de animais em orientações do comitê de investigação que usam uma injeção intra-peritoneal de uma overdose letal de pentobarbital: 300 ï¿½ de 5,47% pentobarbital. </li><li> Remover rato da gaiola e recebe linjeção Ethal pelo operador. </li><li> Após a injecção, transferir o mouse sozinho para outra gaiola, escondido de todos os outros animais. Observe o mouse até ausência de movimento. Confirmar a morte é por falta de movimento, movimento particularmente respiratória, falta de pulso. </li><li> Realizar a coleta cirúrgica de amostras em animais mortos, portanto, sem anestesia nem analgésicos. </li></ol></li><li> Coleta de amostra cirúrgica: Estágio Torácica. NOTA: Para manter condições estéreis, toda a cirurgia é realizada utilizando equipamento estéril em um ambiente de nível de biossegurança 2. <ol><li> Aplicar etanol para a pele. Realize uma incisão na pele da linha média do esterno até meados abdômen com uma tesoura. De incise linha média ao longo da caixa torácica em ambos os lados. Dobra-se a pele de ambos os lados do tórax para visualizar a caixa torácica. </li><li> Realizar uma incisão vertical da caixa torácica em ambos os lados subindo em direcção ao clavícula, a fim de ser capaz de reclinar a parede torácica anterior com toda a popaUM permitindo a visualização perfeita do coração e pulmões (Figura 5A, 5B). </li><li> Recolha de sangue com uma seringa pré-heparined através de punção do coração próxima à artéria interventricular. Retirar um mínimo de 500 ul para se obter, pelo menos, 100 uL de plasma. Coloque a amostra de sangue no gelo. </li><li> Realize uma incisão cervical na linha média para visualizar a traquéia (Figura 5B e 5C). Dissecar cuidadosamente a fáscia em torno da traquéia. Coloque um sutura atrás da traqueia (Figura 5C e 5D). Posteriormente, a sutura será fechada em torno da agulha canulação para assegurar a lavagem adequada. </li><li> Cateterize a traqueia usando a 20-G modificado agulha de gavagem (Figura 5D e 4A). Dê um nó cirúrgico em torno da traqueia canulada com a sutura previamente colocado. </li><li> Para executar lavagens broncoalveolares (LBA), suavemente e progressivamente injectar e extrair 500 ul de PBS gelado no / do pulmão. Colocar a amostra no ice para evitar a lise celular. </li><li> Repetir o passo 5.3.6, 3 vezes para se obter um total de 1500 ul de fluido BAL e piscina amostras de lavagem para um tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E). </li><li> Remova os pulmões do peito. Coloque um segmento do pulmão (o tamanho que correspondem à metade de um pulmão ou um lóbulo) em 1,5 ml tubo de centrífuga e armazenar rapidamente a - 80 ° C. </li><li> Coloque um segmento de pulmão em um tubo de hemólise pré-pesado contendo PBS para determinar a carga bacteriana e colocá-lo em gelo. </li></ol></li><li> Coleta de amostra cirúrgica: Estágio abdominal. <ol><li> Execute outra incisão no lado esquerdo do abdômen. Observe o baço através do peritônio. </li><li> Remover o baço e coloque em um segundo tubo de hemólise contendo 1 ml PBS e colocar no gelo. </li></ol></li><li> Lung índice de lesão NOTA: a permeabilidade da membrana alvéolo-capilar é avaliada por medição marcado com FITC-albumina vazamento do compartimento vascular para o alvéolo-interstcompartimento itial. <ol><li> Centrifugar amostra de sangue e fluido BAL durante 10 min a 1.500 x g. Recolher os sobrenadantes para novos tubos de centrífuga. As pelotas de células de plasma correspondem a ou BAL recrutados e deve ser colocado sobre gelo. </li><li> Adiciona-se 100 ul de cada sobrenadante de sangue (plasma, amarelo) ou BAL sobrenadante para uma placa de 96 poços transparentes (300 ul poços). Coloque uma folha sobre a placa se não for usado imediatamente. </li><li> Medir os níveis de fluorescência do plasma e em sobrenadantes de BAL utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação, 487 nm; emissão, 520 nm). </li><li> Determinação do índice de lesão pulmonar por meio do cálculo da taxa de fluorescência [(BAL sobrenadante / sangue sobrenadante) x 100]. </li></ol></li><li> Lavagem (BAL) contagem de células broncoalveolares diferencial. NOTA: Use o agregado de células obtidas a partir de centrifugação do LBA no passo 5.5.1. <ol><li> Se necessário, use-tampão de lise de glóbulos vermelhos. Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas no tubo de centrífuga contendo o cell pellet. Resumidamente vórtice e deixar 10 min em gelo. Adicionar 500 mL PBS para parar de lise de células vermelhas. </li><li> Células colheita por centrifugação durante 10 min a 1.500 x g. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril. Enumerar as células em um hematocytometer Mallassez. Usando um hemocitômetro para contagem de células. Concentre-se as células em um slide com uma cytospin. </li><li> Células mancha usando kit coloração permitindo a identificação e contagem de células (macrófagos, linfócitos, neutrófilos). </li></ol></li><li> Lung carga bacteriana e disseminação bacteriana NOTA: Para avaliar a carga bacteriana pulmão e disseminação de bactérias, pulmões e baço foram, respectivamente, recolhidos e armazenados em tubos de hemólise pré-pesadas contendo 1 ml de PBS (passo 5.3.9). <ol><li> Pesar tubos de hemólise contendo 1 ml PBS e ou pulmonares ou do baço. Homogeneizar as amostras com um homogeneizador de tecidos para se obter tecidos de pulmão homogeneizados de baço e homogeneizados. </li><li> Deposite 100 l de homo tecidogenates em tubos de centrífuga contendo 900 ul de PBS estéril para obter diluições logarítmicas em série. </li><li> Placa das duas últimas amostras diluídas adequadas (10 -3 e 10 -2) em ambos BCP-agar para P. aeruginosa ou agar YPD-amicacina suplementado para C. albicans pulmão e baço determinação carga. </li><li> Incubar as placas de O / N a 37 ° C. No dia seguinte, enumerar as colónias em placas. </li><li> Índice o resultado ao peso do pulmão para obter uma CFU por grama de pulmão. O tamanho das amostras de pulmão não são os mesmos, os resultados são expressos em CFU por grama de pulmão. Fórmula para o índice é: [UFC] x [peso do tubo de hemólise e de pulmão] - [peso do tubo de hemólise]. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Modelos animais, particularmente mamíferos, são úteis para elucidar os mecanismos complexos de interacção hospedeiro-patogénio nas áreas de imunidade. Claro, a necessidade de informações obtidas somente a partir de modelos animais deve ser essenciais; caso contrário, a utilização de animais devem ser substituídos por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra a percepção de que só pode ser fornecida por um modelo animal uma vez que a interacção entre agentes patogénicos é mediada por uma resposta do hospedeiro multi-componente. Camundongos atualmente utilizados para estudar essa interação patógeno-hospedeiro são jovens adultos com idades entre 6 a 10 semanas com uma resposta imune maduro e inalterados. Quando a focagem sobre a resposta imune inata, são preferidos C57BL6 / J fundo ratinhos. Para evitar um efeito de sexo e ciclo hormonal (particularmente estrogénio) sobre a resposta imunológica, os machos são, por conseguinte, a melhor escolha. Para alcançar significância estatística, os grupos devem ter pelo menos 5 indivíduos no final da experiência, mas, tal como sugerido por todos os animais experimenorientações tação, o número de animais utilizados devem ser reduzidos e refinado a um mínimo estrito. Transporte do criador fornecer os animais para o centro de pesquisa induz estresse em ratos. A conseqüência é um aumento da secreção de citocinas inflamatórias que podem alterar experimentos subsequentes como a nossa. Além disso, um novo ambiente e novos &quot;companheiros de gaiola&quot; contribuir para o estresse. Consequentemente, os ratos devem ser aclimatados durante pelo menos sete dias antes de estudar em seu novo ambiente de habitação. Este ambiente de alojamento tem de ser controlada, fornecendo alimentos padrão e água ad-lib, um ciclo de dia / noite, e umidade estável apropriado e temperatura. Ambos colonização pulmonar e os modelos de infecção pulmonar requerem prática e destreza. A instilação pode ser realizado intra-nasal ou intra-traqueal. Este último é mais difícil e requer uma maior especialização por meio de treinamento devido a um alto risco de parada cardíaca anóxica. Com efeito, o procedure requer para entubar com sucesso um rato em menos de 15 segundos e anestesia mais profundos, portanto, necessários. A nossa escolha de instilação intra-nasal é mais fácil de realizar uma vez que a via de administração é acessível, menos arriscada requerendo anestesia leve e, portanto, é mais reprodutível. Boutoille et al já descrito o nosso modelo de lesão pulmonar aguda, em especial a avaliação de lesão pulmonar através da medição da permeabilidade barreira alvéolo-capilar utilizando albumina marcado com FITC 16. Para reduzir o número de murganhos por experiência, este método foi adaptado e acoplado com lavagem broncoalveolar (BAL). Nos estudos de Boutoille et ai, utilizou-se a comparação entre a fluorescência da albumina-FITC etiquetado nos sobrenadantes de homogeneizado de pulmão e os sobrenadantes de sangue 17. Para realizar plenamente esta comparação, os níveis de hemoglobina e hematócrito também são necessários. Este método foi adaptado para allow a análise concomitante de resposta do hospedeiro, dedicando um pulmão para homogeneização e avaliação da lesão pulmonar eo outro para lavagem e estudo da resposta do hospedeiro. Com efeito, o fluido BAL pode ser usado para avaliar os níveis de citocina, a secreção de proteínas e recrutamento de células. A nossa adaptação fornece mais resultados de uma única experiência com animais, reduzindo o custo e o número necessário de ratos, especialmente quando se utiliza ratinhos knock-out 17 como recomendado nas orientações experimentação animal. Além disso, uma parte do pulmão é mantida a -80 ° C para realizar a extracção de ARN total e de reacção em cadeia da polimerase quantitativa ou análise histológica. A comparação entre o método anterior e o novo método adaptado acoplado com LBA mostra resultados comparáveis ​​(Figura 3A) para avaliar o índice de lesão pulmonar. No estudo de Mear et ai, utilizando os mesmos procedimentos, citómetro de fluxo de análise foi realizada sobre as células de BAL obtidas por centrifugação do fluido de BAL. Um semelhantenalyses foram realizados em células pulmonares totais a partir dos pulmões de 12. Neste caso, a avaliação da lesão pulmonar com albumina marcado com FITC não podem ser realizados concomitantemente, devido a artefactos induzidos por FITC (o mesmo canal do que a proteína de fluorescência verde). Portanto, se citometria de fluxo é necessária, os experimentos devem ser planejadas de acordo. O momento da eutanásia é crítica. Um curso de tempo do modelo de infecção pulmonar aguda durante as primeiras 72 horas é apresentado Figura 3. Neste modelo, o auge da lesão pulmonar e resposta do hospedeiro ocorre entre 24 e 36 horas (Figura 3). Assim, em nosso projeto do ponto final de 24 horas foi escolhido como uma leitura por 3 motivos: em primeiro lugar, é fácil de organizar em laboratório, segundo, para evitar a perda de ratos devido à mortalidade entre 24 e 36 horas, e, finalmente, porque a resposta do hospedeiro foi máxima neste ponto de tempo. O primeiro passo do nosso estudo de interacção representa a colonização das vias aéreas com &lt;em&gt; C. albicans. Usando uma instilação de 10 5 UFC por mouse, um modelo de persistência de 4 dias é obtido sem qualquer lesão pulmonar. Na verdade, os ratos ganharam peso durante o curso de tempo desta fase. O ganho de peso é um indicador útil da ausência de lesões em conformidade com a colonização em oposição à infecção. Com efeito, um aumento da carga inicial (ao longo de 10 6 CFU por ratinho) lesão pulmonar induzida (Figura 2C) e uma série de resposta prejudicial muito além de escorvamento, na qual os ratos perderam peso de casos (Figura 2D). Pelo contrário, usando uma carga menor inicial (por exemplo, 10 4 CFU por ratinho) de um modelo de persistência das vias aéreas não poderia ser obtida. Assim, para obter o escorvamento observada da imunidade do hospedeiro descrito por Mear et al 12, a calibração da carga fúngica instilado é crítica para o sucesso e o controlo da curva de controlo de peso é uma chave. A mesma precisão é necessário para P. aeruginosa </em&gt; para induzir uma infecção aguda. Um inóculo insuficiente não induz lesão pulmonar e P. aeruginosa é rapidamente removido das vias respiratórias por uma resposta hospedeiro apropriado. Usando um excessivamente alta P. inicial aeruginosa ultrapassa as capacidades de defesa do hospedeiro ou até mesmo induz uma resposta inadequada e derleterious resultando em carga leva a lesão aguda maciça e morte de apagar todas as diferenças entre os grupos. O inoculo óptima para induzir lesão aguda depende da presença de um sistema do tipo 3 secreção funcional (T3SS) e a produção de exotoxina de L, uma toxina translocado pelo T3SS para o citoplasma da célula hospedeira. Estes dois atributos específicos de estirpe tem que ser considerado na escolha da carga bacteriana inicial. Encargos bacterianas iniciais são sugeridas neste artigo como exemplos de limites inferiores e superiores para induzir lesão pulmonar aguda com T3SS-negativos ou tensão positiva, e cepas produtoras de exotoxina U ou não (Tabela 1). Ao estudarenvolvimento de T3SS, estirpe tem de ser cultivadas S / N e para reaquecer com novo meio LB 3 h antes da preparação do inoculo para se obter uma actividade óptima de T3SS. A determinação da carga bacteriana e fúngica de 24 horas após P. infecção pulmonar induzida por aeruginosa requer considerações específicas discutidas nesta seção. Com efeito, como se mostra, quando os ratinhos foram infectados com 5 x 10 6 CFU estirpe T3SS-positiva, a carga bacteriana nos pulmões ao 24 h vontade diminuída para cerca de 1 log (Figura 3C). Diluições em série das amostras deve ser realizada até à diluição 5-log e plaqueadas em placas de agar-BCP. No que se refere C. albicans nos pulmões, em 72 h, a carga fúngica é diminuída para cerca de 2 log e as amostras devem ser plaqueadas em YPD-agar suplementado com amicacina para facilitar a identificação de colónias. Finalmente, a determinação de difusão bacteriana pode ser avaliada através do plaqueamento de 100 ul de amostra de sangue em BCP-ágar ou por plaqueamento de 100 ul de baço homogenates no mesmo meio. Os dois métodos foram já foram comparados e cultura baço parece ser mais preciso. Na verdade, o baço é um órgão que &quot;filtros&quot; sangue total e pode &quot;concentrar&quot; e conservar bactérias ter disseminado para o sangue. Assim, os homogeneizados de baço refletem a disseminação bacteriana sistêmica durante a infecção pulmonar aguda com uma sensibilidade maior do que sangue. As amostras de sangue representam difusão bacteriana em um determinado momento muito específico e pode não reflectir verdadeiramente o fenómeno de difusão bacteriana como um todo. Portanto são preferidas culturas de baço homogeneizado. Lung índice de lesão é uma avaliação sensível de lesão pulmonar resultante de infecção e / ou inadequada resposta do hospedeiro eo efeito de potenciais terapias sobre esses componentes. Além disso, este em viv o modelo permite a coleta de várias amostras diferentes para estudar a resposta do hospedeiro. Pulmonar pode ser utilizada para a extracção de ARN e a análisede transcrição do gene. Amostras de pulmão também pode ser colocado em paraformaldeído (PFA) a mais observações histológicas. LBA pode ser utilizado para a avaliação da secreção de proteína, tais como citocinas inflamatórias. Finalmente, como discutido acima o protocolo pode ser adaptado para proporcionar amostras para análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo pode ser adaptado para modelizar C. interação micróbios albicans- envolvidos em pneumonia associada à ventilação mecânica, como Staphylococcus aureus 18 ou enterobactérias. Uma outra adaptação pode ser colonização das vias respiratórias por meio de bactérias, em vez de C. albicans de modelizar bacteriana interacção na doença pulmonar crónica supurativa como bronquiectasia. Para este fim, os ratinhos imunocomprometidos têm de ser utilizados, porque a eliminação bacteriana em ratinhos imunocompetentes não permite uma colonização persistente das vias respiratórias. Para a instilação, a posição da mão segurando o animal é critica. Como já salientado na seção anterior, quando intra-nasal incutir o mouse, o operador deve assegurar que a boca está perfeitamente fechada para evitar a expectoração da solução. O polegar suporta a maxila e mantém a boca fechada durante todo o processo de instilação (Figura 4B). Em seguida, com a outra mão, a pipeta é depositado sobre uma narina (Figura 4C) e solução progressivamente instilada suavemente e sem ar, para evitar a formação de bolhas. Obviamente, a instilação deve ser realizada em um nível armário 2-biosegurança. Recolha de amostras requer pequenos animais treinamento cirúrgico Certifed do operador. Em cada passo, as amostras devem ser colocadas em gelo para evitar a lise das células e preservar proteínas de desnaturação. Instrumentos cirúrgicos necessários são básicos (Figura 4A). Eles devem ser esterilizados em autoclave antes da utilização. Recomenda-se que os diferentes conjuntos de instrumentos cirúrgicos para ser usado abdominal e passos cirúrgicos torácicos, evitando a contaminação cruzada de amostras de pulmão. As diferentes etapas críticas de dissecção cirúrgica são apresentados (Figura 5A-5E). Posição do mouse é crítica; o animal deve ser imobilizado plana sobre ele está de volta cabeça oposto do operador e em linha reta. O etanol deve ser usado livremente para preparação antes da primeira incisão para evitar a propagação de cabelo nas amostras e potencial contaminação bacteriana da pele. A pele é bem vascularizado e deve ser recolhido cuidadosamente para evitar uma hemorragia (Figura 5A). Em seguida, a caixa torácica é reclinado na sequência de uma incisão lateral do tórax, durante o qual a caixa torácica deve ser constantemente mantido sob o domínio pinça para evitar lesões no coração e pulmões durante a incisão. Pulmão e coração estão expostos (Figura 5B). Pulmão não infectados aparecem esbranquiçada (Figura 5B). Dissecção da região cervical expõe a traqueia e uma sutura é carroefully colocado atrás da traqueia superior (Figura 5C). Canulação da traquéia deve ser realizada com cautela. Não utilizar uma cânula de grandes dimensões (tamanho máximo é de 20 G). Uma pequena incisão anterior da traqueia membranosa entre dois anéis cartilagíneos permite a inserção da cânula. Quando a cânula é observado por transparência através da traqueia acima da carina (Figura 5D), o fio de sutura está firmemente amarrada em torno da traqueia prendendo-o em torno da cânula (Figura 5E). A cânula é ligada a uma válvula de bloqueio Luer macho de 3 vias com 2 seringas ligados às portas do sexo feminino. Uma seringa contém PBS gelado para lavagem broncoalveolar; o outro é vazia para chamar de volta o LBA. Estas seringas devem ser chaged entre grupos. Em conclusão, priming antes do modelo de lesão pulmonar aguda é um modelo relevante e poderosa para explorar nas interações mediados pelo hospedeiro vivo entre patógenos. A utilização de animais é alimitação principal e devem ser cuidadosamente ponderados em relação a informações obtidas in vitro.

Os modelos animais, especialmente ratinhos, têm sido extensivamente utilizados para explorar as respostas imunitárias contra os agentes patogénicos. Embora a imunidade inata e adquirida diferem entre roedores e humanos 7, a facilidade na criação e no desenvolvimento de nocautes para numerosos genes, fazer camundongos um excelente modelo para estudar as respostas imunes 8. A resposta imune é complexo e resulta da interacção de um agente patogénico, da flora residente microbianas e vários imune (linfócitos, neutrófilos, macrófagos) e não-imune (células epiteliais, células endoteliais) tipos celulares 2. Os estudos in vitro não permitem observar essas interações complexas e centrar-se principalmente nas interações célula-patógeno únicas. Enquanto modelos animais deve ser utilizado com precaução e limitada a questões muito específicas e relevantes, modelos de ratos proporcionam uma boa perspectiva sobre a resposta imune mamífero in vivo e pode dirigir peças de questões clínicas importantes 7. 6. Enquanto que constitui um microbiome &quot;normal&quot; via aérea continua a ser determinado, comunidades residentes são frequentemente polimicrobiana, e originam a partir de diversas fontes ecológicos. Os pacientes com doença crônica supurativa pulmonar (fibrose cística, bronchectasis) ou pacientes sob ventilação mecânica apresentam uma flora especial devido à colonização das vias aéreas por microrganismos ambientalmente adquiridos 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são ambos problema patógenos 5, freqüentemente isolado em conjunto a partir de amostras traqueobrônquicos , e responsável de infecção oportunista grave nesses pacientes, especialmente na unidade de terapia intensiva (UTI) 4. O isolamento desses microrganismos durante pneumonia aguda em resultados de UTI no tratamento anti-microbiano contra P. b aeruginosaut levedura geralmente não são considerados patogênicos neste local 5. in vitro interações entre P. aeruginosa e C. albicans têm sido amplamente relatado e mostraram que esses microrganismos podem afectar o crescimento e a sobrevivência de outro, mas estudos não foi possível concluir se a presença de C. albicans é prejudicial ou benéfica para o hospedeiro 10. Mouse modelos foram desenvolvidos para abordar esta relevância do P. aeruginosa e C. albicans in vivo, mas a interação entre microrganismos não foi o ponto-chave. De facto, o modelo foi estabelecido para avaliar o envolvimento da C. albicans na resposta imune do hospedeiro, e resultado. Um modelo anterior estabelecida por Roux et ai já utilizada uma colonização inicial com C. albicans seguido de uma infecção pulmonar aguda induzida por P. aeruginosa. Usando seu modelo, os autores encontraram um papel deletério da prior C. albicans colonização 11. No entanto Roux et al utilizaram uma carga elevada de C. albicans em seu modelo com 2 x 10 6 CFU / rato durante 3 dias consecutivos. Nós estabelecemos um modelo de 4 dias de C. colonização das vias aéreas albicans, ou pelo menos persistência sem lesão pulmonar, Neste modelo C. albicans foi recuperado até 4 dias após uma única instilação de 10 5 CFU por ratinho (Figura 2B) 12,13. Após 4 dias, não se observou qualquer evidência de recrutamento de células inflamatórias, a produção de citoquinas inflamatórias, nem dano epitelial. Em 24-48 horas, na presença de pico de C. albicans, apesar de uma resposta imune inata celular e de citoquina foi observada, não houve evidência de lesão pulmonar. Surpreendentemente, os murganhos assim colonizada com C. albicans 48 horas antes da instilação intranasal de P. aeruginosa tinham infecção atenuada em comparação com ratinhos com P. aeruginosa infecção sozinho. Euom efeito, os ratinhos exibiram menor lesão pulmonar e diminuição da carga bacteriana 12,13. Várias hipóteses poderiam explicar o efeito benéfico da colonização prévia com C. albicans em P. aeruginosa mediada por infecção pulmonar aguda. Primeiro, um cross-talk entre espécies envolvendo cada microorganismos sistemas de sensoriamento quorum, o P. baseada homoserinelactone sistema aeruginosa e C.-base de farnesol sistema albicans, foram avaliados. Em segundo lugar, C. foi estudada albicans agindo como um alvo &quot;chamariz&quot; para P. aeruginosa desviar o agente patogénico a partir de células epiteliais do pulmão. Ambas as hipóteses foram invalidados (dados não publicados). A terceira hipótese era a de um &quot;priming&quot; do sistema imune inato por C. albicans responsável por uma resposta inata subsequente reforçada contra P. aeruginosa. Esta última hipótese foi confirmada. Na verdade C. colonização albicans levou a uma iniciação da imunidade inata atraGH IL-22, segregada principalmente pelas células linfóides inatos, resultando num aumento da depuração bacteriana e reduziu a lesão pulmonar 12. Em conclusão, o anfitrião é um ator central na interação entre microrganismos modulação da resposta imune inata e que envolvam diferentes tipos de células inflamatórias. Embora estas interacções imunes complexas podem ser dissecados in vitro as hipóteses iniciais só pode ser fornecida por adequado em modelos in vivo. O protocolo seguinte fornece um exemplo de estudo in vivo de interacção hospedeiro-patogénio mediada que pode ser adaptado a outros microrganismos.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader Mithras&amp;nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>reference in first column</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Bromo-cresol purple agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>20x per unit</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>2-headed valve&amp;nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Sterile inoculation loop 10 &amp;micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 conditioning</td></tr><tr><td>Insuline syringes 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>per 100 conditioning</td></tr><tr><td>2 positions Culture tube 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&amp;nbsp;</td><td>General Electric life sciences</td><td>80-2116-30</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Hemolysis tubes 13 x 75 mm&amp;nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>packaged in 500 ml</td></tr><tr><td>amikacin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>per 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin 10,000 UI in 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x per unit</td></tr><tr><td>RAL 555 coloration kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons of 100 mL</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparent 300 &amp;micro;l 96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in powder</td></tr><tr><td>FITC-albumin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in powder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in powder</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Terumo or unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditioning</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>no comment</td></tr></tbody></table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

Estudar interação patógeno-hospedeiro nos permite compreender os mecanismos subjacentes da patogenicidade durante a infecção microbiana. O prognóstico do hospedeiro depende do envolvimento de uma resposta imune contra o patógeno adaptado 1. A resposta imune é complexo e os resultados a partir da interação dos agentes patogénicos e vários tipos celulares imunes ou não imunes 2. Os estudos in vitro não pode caracterizar essas interações e foco em interações celulares-patógeno. Além disso, nas vias aéreas 3, particularmente em doentes com doença pulmonar crônica supurativa ou em pacientes sob ventilação mecânica, comunidades polimicrobianas estão presentes e complicar interação patógeno-hospedeiro. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são tanto problema patógenos 4, freqüentemente isolado de amostras traqueobrônquicas, e associado a infecções graves, especialmente na unidade de cuidados intensivos 5. Interações microbianas temfoi relatado entre esses patógenos in vitro, mas o impacto clínico destas interações ainda não está claro 6. Para estudar as interações entre C. Albicans e P. aeruginosa, um modelo de murino de C. colonização albicans vias aéreas, seguido de um p infecção pulmonar aguda mediada aeruginosa- foi realizada.

Como visto anteriormente durante a descrição do protocolo, o experimento precisa de cinco dias para ser concluído (Figura 1: Experiência linha do tempo). Um operador é solicitado durante toda a execução do experimento e pode lidar com os processos até um máximo de 10 ratos. Se forem necessários mais animais, duas pessoas são necessários particularmente para coleta de amostras cirúrgico. Na verdade todas as amostras devem ser recolhidos em menos de 2 horas para evitar um aumento da fuga de alvéolo-capilar passiva de albumina marcado com FITC nos últimos camundongos. O primeiro passo é a preparação de C. inóculo albicans e instilação intra-nasal para obter a colonização das vias aéreas por C. albicans. Um modelo de 4-dias persistência é obtida por instilação intranasal de 5 x 10 5 CFU de C. albicans por ratinho (Figura 2B). Durante estes 4 dias, os ratinhos ganho de peso (Figura 2A) e a instilação de 5x10 5 CFU não induz lung lesão (Figura 2C). Embora C. albicans pode persistir até 4 dias neste modelo, a carga diminui após 48 horas. Portanto, P. infecção pulmonar aguda induzida por aeruginosa é efectuada em 48 horas de C. persistência albicans. P. aeruginosa PAO1 estirpe é uma cepa de laboratório em grande parte caracterizada compreendendo o principal fator de virulência, o tipo de sistema de três secreção (T3SS), como em 75% dos isolados clínicos de pulmão 15. Por razões teses, PAO1 é uma estirpe relevante em modelos animais de infecção pulmonar aguda. A lesão pulmonar é avaliada através alvéolo-capilar permeabilidade medida pelo vazamento de proteína a partir do compartimento vascular para a via aérea expresso como o índice de lesão pulmonar. Lesão Pulmonar aumenta com o inoculo (Figura 3A). Aqui nós relatamos cinética da componente lesão pulmonar aguda do nosso modelo induzida pela estirpe PAO1 (5x10 6 UFC / mouse) (Figura 3B-3F) sozinho, sem préviaC. albicans- escorva mediada. Dependendo da estirpe e tempo de percurso do modelo, a escolha de P. inicial aeruginosa inoculo é discutido na secção seguinte e é sugerido na Tabela 1. Utilizaram-se cinco ratinhos por grupo. Índice de lesão pulmonar (Figura 3B), a carga bacteriana no pulmão (Figura 3C), a carga bacteriana no baço, reflectindo difusão bacteriana (Figura 3D), celularidade no LBA (Figura 3E) e contagem de células diferencial (Figura 3F) foram determinados a cada 12 h. A lesão pulmonar foi máxima entre 24 h e 36 h após a infecção (Figura 3B). Mostrou uma carga bacteriana 1-log UFC / mL diminuir a cada 24 h (Figura 3C). Disseminação bacteriana acumulada avaliada por culturas homogeneizado baço aumentado a cada dia (Figura 3D). Finalmente, embora a celularidade do LBA em ratinhos não infectados é principalmente composta (90%) Omacrófagos alveolares de f, no LBA de ratinhos infectados, os neutrófilos foram amplamente recrutados e contagem de células diferencial mostrou 90% de neutrófilos e 10% de macrófagos e linfócitos (Figura 3E, 3F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig1.jpg" /> Figura 1. Timeline da Lesão Pulmonar Aguda Modelo de Interação mediada Explorar-Host entre C. albicans e P. aeruginosa. Representação gráfica de todo o procedimento. O primeiro passo é a adaptação do ambiente de ratos As instalações de alojamento. O segundo passo é C. albicans mediada colonização das vias respiratórias. Finalmente, o terceiro passo é a infecção pulmonar aguda mediada por P. aeruginosa. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53218/53218fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig2.jpg" /> Figura 2. C. albicans vias aéreas Colonização. (A, B) Os ratinhos são instilado intranasalmente com 10 CFU 5 C. albicans (SC5314 tensão). Mice ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas albicans mediada por (A). Colonização das vias aéreas pode ser prolongada para 3-4 dias com uma única instilação inicial. Em um estudo anterior, priming da imunidade inata ocorre entre 24 e 48 horas. (n = 5 por grupo), as barras de erro representam a média ± SD. (C, D) os ratos são instilados por via intranasal de 5 x 10 5 ou 5 x 10 6 CFU de C. albicans. Índice de lesão pulmonar (C) avaliados por alveolar permeabilidade da barreira capilar às 24 h. O ganho de peso (D) expressa como percentagem do peso inicial (n = 5 por grupo).As barras de erro representam médias ± SD. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53218/53218fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig3.jpg" /> Figura 3. Modelo de lesão pulmonar aguda induzida por P aeruginosa. (A) C57BL / 6J são intra-nasalmente infectados com cargas crescentes de P. aeruginosa (a partir de 1 x 10 6 a 5 x 10 7 CFU por ratinho) (n = 5 por grupo), as barras de erro representam a média ± SD. Os ratinhos são sacrificados às 24 h. Lung índice de lesão é avaliada pela permeabilidade da barreira alvéolo-capilar que aumenta proporcionalmente com a carga bacteriana. Comparação do índice de lesão pulmonar obtido utilizando o método antigo com pulmão homogeneizados de sobrenadantes (barras pretas) e novo método combinado utilizando sobrenadantes de lavagem broncoalveolar (barra cinzas) (BF) ratos são intra-nasal infectada com 5 x10 6 UFC por mouse. Os ratos são sacrificados a cada 12 a 48 horas para cinética agudas modelo lesão. A lesão pulmonar (B), pulmão carga bacteriana (C), baço carga bacteriana (D), a lavagem broncoalveolar (LBA) celularidade (E) e contagem de células diferencial BAL (F) também são avaliadas. (n = 5) por grupo, barras de erro representam médias ± DP. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53218/53218fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig4.jpg" /> Figura 4. Equipamento Cirúrgico e instilação intranasal. (A) &#160; Equipamento cirúrgico necessário para executar modelo de lesão aguda e lavado bronco-alveolar. Aqui cânula traqueal (20G) e as duas seringas de 1 ml estão ligados a uma válvula de 3-vias Luer-lock. Uma seringa para injectar água para os pulmões, um para extrair o fluido de volta para fora broncoalveolar dos pulmões. (B, C) &#160; Posição do mouse na mão para executar a instilação intra-nasal. Nesta foto, o polegar sob a mandíbula garante uma boca fechada durante a instilação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53218/53218fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig5.jpg" /> Figura 5. Cirurgia e lavado bronco-alveolar. O peito é amplamente aberto (A), e caixa torácica é aberta lateralmente para evitar danos ao coração (B). Após a recolha de sangue, a área do colo do útero é dissecada para expor a traqueia (C). O fio dental é usado como umsutura é passado para trás e traqueia (C, D). A traqueia é canulada, em seguida, com a cânula de 20-G combinada (D), montada na seringa e a válvula de 3 vias. A traquéia deve ser bem preso ao redor da cânula por amarrar um nó cirúrgico utilizando a sutura no lugar por trás da traquéia. Finalmente 500 uL de PBS são suavemente instilado nos pulmões e, em seguida, a BAL é desenhado gentilmente para fora. (E) pulmões incutiu-Fluid. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53218/53218fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td></td><td> Burden incutiu Minimal </td><td> Maximal incutiu Burden </td></tr><tr><td> T3SS- </td><td> 5 x 10 7 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> T3SS + </td><td> 5 x 10 6 </td><td> 1 x 10 7 </td></tr><tr><td> T3SS + exoU + </td><td> 5 x 10 <sup&gt; 4 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. P. aeruginosa inóculos Usado em Infecção pulmonar aguda Models. Intranasais concentrações ideais sugeridos de inóculos para induzir lesão pulmonar aguda segundo as estirpes.

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Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.4K visualizações.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Estabelecendo um modelo de camundongo para infecção relacionada a cateter associada a Candida albicans

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed on the outer surface of the catheter and lead to disseminated infections, which are fatal to patients. There are no effective prevention and treatment management in clinics. Therefore, it is urgent to establish an animal model of CRI for the preclinical screening of new strategies for its prevention and treatment. In this study, a polyethylene catheter, a widely used medical catheter, was inserted into the back of the BALB/c mice after hair removal. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressing enhanced green fluorescent protein was subsequently inoculated on the skin's surface along the catheter. Intense fluorescence was observed on the surface of the catheter under a fluorescent microscope 3 days later. Mature and thick biofilms were found on the surface of the catheter via scanning electron microscopy. These results indicated the adhesion, colonization, and biofilm formation of candida albicans on the surface of the catheter. The hyperplasia of the epidermis and the infiltration of inflammatory cells in the skin specimens indicated the histopathological changes of the CRI-associated skin. To sum up, a mouse CRI model was successfully established. This model is expected to be helpful in the research and development of therapeutic management for candida albicans associated CRI.

Autor em destaque: Aprimorando a detecção de Candida albicans em infecções por cateter usando marcação de proteína fluorescente 

We establish a mouse model of C.albicans-associated catheter-related infection (CRI), in which biofilm forms on the catheter, and the interaction between C.albicans and host correlates well with the clinical CRI. This model helps screen therapies for C.albicans biofilm-associated CRI, laying a foundation for clinical transformation.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

Estudar comunidades microbianas

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Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra

Crônica de Longo Prazo

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Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

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