Name: analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions at JoVE.com

We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. pico de emissão e Cross-talk Determinação (ver figura 2) <ol><li> A fim de determinar os picos de emissão e quantidade de diafonia entre o doador (derivado cumarina V450) e do aceitador (fluoresceína) corantes, efectuar análises espectrais de ambas as células marcadas com fluoróforos individuais a 405 nm de excitação. </li><li> Determinar uma largura de banda de 10 nm no pico de cada corante que vai ser utilizado para os dadores e aceitadores (aqui canais a 455-465 nm e 525-535 nm). Traçar a intensidade normalizada ao longo do comprimento de onda e calcular a percentagem média de cross-talk do corante doador no canal receptor e vice-versa (Figura 2). </li></ol> 2. Preparação de Y. enterocolitica Cepas para celular Cultura Infecção <ol><li> Use as seguintes estirpes: WA-314 PMK-óvulos (WA-314 transformada com os plasmídeos PMK-bla 17 e PMK-óvulos 17, respectivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformada com o plasmídeo PMK-bla 17) </li><li> Pelo menos dois dias antes da raia infecção Y. enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-blá de crio stocks em placas de LB-agar contendo os antibióticos necessários (canamicina para WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-óvulos ; canamicina e tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) e crescer O / N a 27 ° C. Depois manter as placas durante até uma semana a 4 ° C. </li><li> Um dia antes da infecção inocular 3 mL de meio LB contendo os antibióticos necessários com uma colónia das respectivas estirpes e incubar O / N a 27 ° C num agitador a 180 rpm. </li><li> No dia da infecção inocular 2 ml da cultura D / N em 40 ml de meio fresco LB sem antibióticos e incubar durante 90 min a 37 ° C num agitador a 180 rpm, para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo III. </li><li> Transferir as culturas para um tubo apropriado e manter as culturas em gelo ou a 4 ° Cdaqui em diante. Centrifugar as culturas durante 10 min a 5000 xg e 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento bacteriano em 2-3 ml de PBS gelado. Dilui-se a suspensão bacteriana a uma concentração de 8 x 10 8 ufc / mL, utilizando um espectrofotómetro. Determinar a densidade óptica correspondente individualmente. Mantenha esta suspensão em gelo até infectar as células HeLa. </li></ol> 3. As células HeLa Galvanização <ol><li> Um dia antes da semente de infecção de 1,5 x 10 4 células HeLa em DMEM de 200 ul contendo 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) em poços de uma placa de 96 poços em cultivar e um 5% de CO2 a 37 ° C. Semente três poços para cada cepa (três tempos de incubação diferentes). </li></ol> 4. A infecção de células HeLa e carregando com CCF4 <ol><li> Infectar as células HeLa pela adição de 3,5 ul da suspensão bacteriana para a forma e misturar por pipetagem suave do meio duas vezes. Permitir que as bactérias para sedimentar emàs células a um MOI (porção de infecção) de cerca de 100 bactérias por célula. Para iniciar um curso de tempo de infecções a -90 min, -60 min e -30 min e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 até 0 min para atingir um ponto final comum. </li><li> Quando a incubação estiver completa, cuidadosamente aspirar o meio, sem a remoção de células HeLa e adicionar 50 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol para parar a expressão de efectores e probenecid 2,5 mM para reduzir a exportação de CCF4. </li><li> Neste ponto transferir a placa de 96 poços na platina do microscópio e definem pontos adequados para análise posterior em cada poço. Terminar esta etapa dentro de 10 minutos (para obter detalhes sobre a aquisição ver secção 5.1). </li><li> Por cavidade, adicionar 70 ul de solução CCF4 / AM de carga (solução 0,24 ul A, 1,2 ul de solução B, de 18,56 ul da solução C (solução A, B e C, desde que dentro do kit / AM carregamento CCF4) e 50 ul de PBS (contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM), utilizando um multi pipette e incubar durante 5 min à TA. A partir de agora trabalhar sem interrupções. </li><li> Aspirar a solução de carregamento e adicionar 100 ul de PBS contendo 20 ug / ml de cloranfenicol e probenecida 2,5 mM usando um multi pipeta. Em seguida, transferir rapidamente a placa de 96 bem no palco microscópio e começar a aquisição no prazo de 10 min da aspiração da solução de carregamento. </li></ol> 5. Laser Scanning Microscopy e Análise de Dados <ol><li> A aquisição de imagens <ol><li> Defina as condições de imagem de forma a maximizar a contagem total de fótons e minimizar fototoxicidade, fotodegradação e cross-excitação. <ol><li> Em um moderno microscópio confocal de varrimento laser, use uma alta objetiva de imersão abertura numérica 20X, abra o pinhole detector de 2,5 unidades Airy (ou seja, ampla seccionamento óptico), escolha de alta sensibilidade GaAsP-detectores com doador e receptor canais ativos simultaneamente, profundidade de 8 bits , ~ 750 nm tamanho do pixel, 3 vezes quadro de média e excite com 10% de um laser de diodo 405 nm. </li><li> Para garantir a correta quantificação definir o ganho do detector de ambos os canais com o mesmo valor e para evitar quaisquer pixels saturadas. Nota: Aqui, os ganhos foram ajustados para 150%. </li></ol></li><li> Assegurar a sua imersão contínua por meio de imersão para espalhar o fundo dos poços, por exemplo com uma seringa de 1 ml, e evitar o aprisionamento de bolhas de ar. </li><li> Ative a luz transmitida e encontrar um campo representante de vista em todos os poços. Use uma fase automática corretamente calibrados e marcar a posição no software. </li><li> Após a remoção da placa por coloração (ver secção 4.3), reinserir a placa e adicionar um peso no topo para evitar deriva focal. Reveja as posições salvas com o modo de varredura a laser e ajustar o foco ea posição lateral corretamente. </li><li> Defina o lapso de tempo de 2 minutos, a duração de 2 horas e começar a aquisição. </li></ol></li><li> Quantificação imagem (exemplos será dado para Bitplane Softwsão como Imaris) <ol><li> Importe o conjunto de dados em software que permite cálculos aritméticos de matrizes de pixel. Faça isso arrastando e soltando o arquivo de origem que contém tanto o doador eo receptor de canal no ícone do software. </li><li> Subtrair o fundo em ambos os canais usando o mesmo deslocamento. Para fazer isso, clique em Menu e, em seguida, clique em Imagem&gt; Processamento&gt; Linha de Base subtração. Selecione cada canal e insira o valor da linha de base. </li><li> Corrija o sangramento-through do canal doador (CH1) para o canal receptor (CH2) com o pré-determinada correção do fator f (ver 1.1), a criação de um novo canal: Ch2 &#39;= Ch2 - Ch1 * f NOTA: Uma sangria através do aceitador para o canal de dador não era detectável em relação ao nível de ruído. <ol><li> Clique em Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Depois excluir Canal 2, clicando em Menu&gt; Editar&gt; Excluir Channels. Certifique-se de que osangrar-through canal receptor corrigido permanece como o novo Canal 2. Opcional: Mude a cor do canal de cinza para a cor original, vá ao menu Editar&gt; Propriedades&gt; Imagem. Selecione Channel 4&gt; mapeada Cor&gt; Cor Base e alterá-lo para, por exemplo, verde. </li></ol></li><li> Criar um novo canal com a seguinte operação para determinar o coeficiente de FRET relação: = CH2 CH3 &#39;/ (CH1 + Ch2&#39;) <ol><li> Vá ao Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e entrar ch2 ./ (CH1 + CH2) </li></ol></li><li> Para visualização adequada do canal FRET em uma imagem de 8 bits, criar um quarto canal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Vá ao Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Canal Arithmetics e digite 255 * ch3. Mude a cor do canal, vá ao menu Editar&gt; Propriedades&gt; Imagem. Selecione Channel 4&gt; mapeada tabela de arquivos Color&gt; Color&gt; Jet. </li></ol></li><li> Aplicar um filtro mediano 3x3 para canais Ch3 Ch4 e that vai reduzir o ruído nas imagens. Para fazer isso, clique em Menu&gt; Processamento de Imagem&gt; Suavização&gt; filtro mediano. Selecione ambos os canais e aplicar um filtro de tamanho &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Para a quantificação de sinais celulares, detectar as células em Ch4 por corretamente configurar o deslocamento e filtrar as estruturas por tamanho para excluir demasiado pequenas estruturas. <ol><li> Selecione o Ultrapasse Exibir e clique no ícone &quot;Adicionar novas superfícies&quot;. Defina os parâmetros do algoritmo de detecção na janela de Superfície. Para um processamento mais rápido, ativar a duas caixas de verificação &quot;Segmento de apenas uma região de interesse&quot; e &quot;todo o processo de Imagem finalmente&quot;. Definir a região de interesse, editando suas dimensões. </li><li> Selecione Channel 4 como o canal de origem e definir o limite por Thresholding&gt; A subtração (Contraste Local) e definir diâmetro de 10 mm. Defina o limite de intensidade mínima manualmente para 0 eo limite máximo para a intensificação máximaty. Filtrar as estruturas por área e definir o valor mínimo para, por exemplo, 187 μm². Termine a detecção de superfície. </li></ol></li><li> Extraia os valores médios de intensidade de fluorescência do doador (CH1) e coeficiente de FRET relativa (CH3) e seus desvios-padrão na entidade celular. Para fazer isso, vá para as propriedades de superfície. Alterar a aparência das estruturas selecionando Surfaces Estilo / Qualidade&gt; Surface. Selecione todas as estruturas, clicando na guia filtros. Unificar as estruturas detectadas indo ao processo de seleção&gt; Unify. Exportar as estatísticas de superfície para o MS Excel, clicando na aba estatísticas&gt; Exportar todas as Estatísticas para arquivo. </li><li> Traçar esses valores ao longo do tempo. Identificar o intervalo de 10 min de inclinação máxima de aumento de fluorescência de canal doador para cada condição como um parâmetro razoável para representar a quantidade de effector translocado. Calcular o declive como m = Δ intensidade de fluorescência de dador / Δ tempo (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Nós, aqui aplicada com êxito um ensaio baseado TEM-1 repórter de beta-lactamase para a análise quantitativa de efector translocation por Y. enterocolitica. Muitas variações diferentes da técnica sensível, específico e relativamente simples têm sido descritos na literatura. Neste estudo de microscopia de varrimento a laser foi realizada para detecção mais sensível e precisa dos sinais de fluorescência. Especificamente, a correcção em função da conversa cruzada entre os corantes dadores e aceitadores e as larguras de banda de detecção ajustáveis ​​individualmente para permitir a medição de precisão superior em comparação com outras variações do método. Os resultados mostram claramente que o método é capaz de analisar quantitativamente a translocação. Tempos de incubação diferentes, representando diferentes concentrações de intracelular de beta-lactamase foram correlacionados positivamente com o declive da intensidade de fluorescência do dador. Também uma taxa significativamente mais elevada translocação da WA-314ΔYopE comparadopara a linhagem selvagem WA-314 poderia ser demonstrada. Duas opções alternativas para a análise dos dados foram aplicados: intensidades canal de Doadores e coeficientes FRET relativos. A vantagem de utilizar o canal do doador é que representa directamente a acumulação de um produto de hidrólise de CCF-4 (cumarina). Esta abordagem é possível em uma configuração microscópica, do que no outro, porque um leitor de placas de correcção para as diferenças de densidades celulares usando uma proporção de dador / aceitador não é necessário. No entanto, a exportação do corante CCF4 ou seus produtos de hidrólise ainda é possível um confundidor nesta abordagem. Esta desvantagem pode ser superada através do cálculo do coeficiente de FRET relativa. Nas experiências adicionais descritos foram realizados em placas de 96 poços. Este formato permite testar várias condições em um único experimento e ajuda a economizar produtos químicos caros (especificamente kit de carregamento CCF4 / AM). No fluxo de trabalho descrito é fundamental para começar imaquisição idade num ponto de tempo definido logo após a adição da solução de carregamento CCF4 / AM, porque a hidrólise de CCF4 pela beta-lactamase translocado começa imediatamente. Em caso de processamento para várias condições ao mesmo tempo, ajuste de foco e posições laterais (passo 5.1.4) pode levar muito tempo e dificultar um início atempado de aquisição de imagem. Portanto, o número máximo de amostras em paralelo tem de ser determinado individualmente. Um dos principais problemas encontrados utilizando este método foi a exportação considerável do substrato CCF4 pelas células HeLa a 37 ° C. Este fenómeno não podia ser suficientemente neutralizados por tratamento das células com o probenecid. Decidimos, portanto, em vez da monitorização translocação durante a infecção em curso, tal como descrito anteriormente, a primeira infecção completa e depois carregar as células com o corante CCF4 / AM. Com esta abordagem, foi possível controlar o tratamento do substrato CCF4 à TA. Sob estas condições reduObservou-se CED exportação de CCF4. A quantidade de exportação do substrato parece ser CCF4 linha celular específico; a configuração descrita aqui permite a análise fiável de translocação também em linhas de células, o que fortemente exportar CCF4 a 37 ° C. A exportação de CCF4 não é um problema em algumas outras linhas de células que permitem a adoptar a configuração de microscopia para monitorar os processos de infecção e, simultaneamente, a translocação em tempo real. Isto proporciona a possibilidade de analisar translocação em células individuais e pode ser utilizado para correlacionar a translocação com eventos específicos de interacção célula hospedeira bacteriana, como a adesão ou a formação de micro-colonias 20. Por isso, este ensaio é uma valiosa ferramenta para melhor elucidar os mecanismos pelos quais a translocação é regulado durante a interação de bactérias e células hospedeiras.

III sistemas de secreção do tipo são máquinas de proteínas para a exportação especializada utilizados por diferentes gêneros de bactérias gram-negativas para entregar diretamente proteínas efetoras bacterially codificados em células alvo eucarióticas. Embora a própria maquinaria de secreção é altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras têm evoluído entre as diferentes espécies de bactérias para manipular vias de sinalização celular e facilitar estratégias bacterianos de virulência específicos 1. Em caso de Yersinia, até sete proteínas efectoras, os chamados (proteínas exteriores Yersinia) Yops, são translocados aquando do contacto da célula hospedeira e agir em conjunto para subverter as respostas das células imunes, tais como fagocitose e produção de citocina, ou seja, para permitir a sobrevivência extracelular das bactérias 2-4. O processo de translocação é rigidamente controlado em diferentes fases 5. Está provado que a ativação primária do T3SS é desencadeada por seu contato com a ce-alvoll 6. No entanto, o mecanismo preciso desta iniciação está ainda a ser elucidados. Em Yersinia um segundo nível de chamada afinação de translocação é conseguido por cima ou para baixo-regulação da actividade das proteínas Rac1 ou RhoA-GTP Rho de ligação celular. Ativação de Rac1 por exemplo, invasina ou citotóxico fator necrosante Y (CNF-Y) leva ao aumento da translocação 7-9, enquanto o GAP (GTPase proteína ativadora) função de translocado YopE down-regula a actividade Rac1 e, consequentemente, diminui a translocação por um tipo de feedback negativo mecanismo de 10,11. Os métodos válidos e precisos são o pré-requisito para investigar como a translocação é regulada durante a interação célula hospedeira Yersinia. Muitos sistemas diferentes têm sido utilizados para esse fim, cada um deles com vantagens e desvantagens específicas. Algumas abordagens assentam sobre a lise de células infectadas mas não as bactérias por diferentes detergentes, seguido por análise Western blot. ºe inconveniente comum destes métodos é que a lise bacteriana pequena mas inevitável potencialmente contamina o lisado celular com proteínas efectoras bactérias associadas. No entanto, foram propostas tratamento de células com proteinase K para degradar proteínas efectoras extracelulares e uso subsequente de digitonina para a lise selectiva das células eucarióticas para minimizar este problema 12. Mais importante, estes ensaios depender crucialmente anticorpos anti-efectoras de alta qualidade, que não são na sua maioria disponíveis comercialmente. As tentativas de utilizar fusões traducionais das proteínas efectoras e proteínas fluorescentes como GFP para monitorar a translocação não foram bem sucedidas provavelmente devido à estrutura terciária das proteínas globulares fluorescentes e a incapacidade do aparelho de secreção para desdobrá-las antes de secreção de 13. No entanto, várias marcas diferentes, como o repórter cya (dependente de calmodulina adenilato ciclase) domínio da toxina pertussis Bordetella cyclolysin 14 ou o Flashtag foram usadas com sucesso para analisar a translocação. No primeiro ensaio, a actividade enzimática de CyA é utilizado para amplificar o sinal da proteína de fusão intracelular, enquanto que a etiqueta do Flash, uma marcação motivo muito curto tetracisteï¿½a (4Cys), permite a marcação com o Flash corante biarsenical sem perturbar o processo de secreção 15. A abordagem aqui aplicado foi relatado pela primeira vez por Charpentier et al., E baseia-se na conversão intracelular da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) por corante CCF4 translocados efectora TEM-1 beta-lactamase fusões 16 (Figura 1A). CCF4 / AM é um composto de células-permeante em que um derivado da cumarina (doador) e uma porção de fluoresceina (aceitador) estão ligadas por um núcleo de cefalosporina. Após a entrada na célula passiva eucariótica, o não-fluorescente esterificado CCF4 / AM composto é processado por esterases celulares para o CCF4 carregada e fluorescente e assim presono interior da célula. Excitação da porção cumarina a 405 nm resulta em FRET para a porção f luoresceina, que emite um sinal de fluorescência verde a 530 nm. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina pelo FRET da beta-lactamase é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul at460 nm. Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, a técnica foi utilizada em um modelo de rato de infecção para identificar as populações de leucócitos identificados para a translocação in vivo 17-19. A leitura dos sinais pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. De nota, o método também fornece a possibilidade de monitorar a translocação em tempo real por meio de microscopia de células ao vivo durante o processo de infecção 20,21. Aqui microscopia de fluorescência de varredura a laser foi aplicado para readout de sinais de fluorescência, pois proporciona maior sensibilidade e precisão. Em particular, a capacidade para ajustar a janela de emissão, com uma precisão nanométrica em combinação com detectores de alta sensibilidade facilita a detecção de fluorescência optimizado e minimizada a diafonia. Além disso, esta configuração microscopia pode ser adaptada para a monitorização em tempo real de translocação e, potencialmente, permite a análise simultânea de interacção hospedeiro-patogénio a nível celular. Neste estudo as taxas de translocação de um Y. enterocolitica estirpe do tipo selvagem e um mutante de deleção YopE exibindo um fenótipo hypertranslocator 10,11, foram exemplarmente analisados.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (black, clear bottom)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>Immersol W immersion oil&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&amp;#160;nm diode laser 50&amp;#160;mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6 software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td></tr><tr><td>MatLab compiler runtime</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Muitas bactérias gram-negativo patogénico incluindo Yersinia spp. Empregam sistemas de secreção de tipo III para translocar proteínas efectoras para células alvo eucarióticas. Dentro da célula hospedeira as proteínas efectoras manipular funções celulares para o benefício de as bactérias. Para entender melhor o controle da secreção de tipo III durante a interação célula hospedeira, sensível e ensaios precisos para medir a translocação são obrigatórios. Nós aqui descrever a aplicação de um ensaio com base na fusão de um fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína exterior Yersinia; YopE). Com TEM-1 beta-lactamase para a análise quantitativa de translocação O ensaio baseia-se na clivagem de uma célula permeante FRET corante (CCF4 / AM) por translocado fusão beta-lactamase. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina de CCF4 pela beta-lactamase, a partir de cumarina FRET para f luoresceina é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul.Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, num modelo de ratinho. A detecção dos sinais de fluorescência pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. Na configuração descrita aqui, a translocação de fusões efectoras in vitro em células HeLa por diferentes mutantes Yersinia é monitorizada por microscopia de varrimento de laser. Gravação de conversão intracelular do repórter de FRET pela fusão efectora da beta-lactamase em tempo real fornece resultados quantitativos fiáveis. Nós aqui mostram dados exemplificativos, demonstrando o aumento da translocação de um Y. enterocolitica YopE mutante em comparação com a linhagem selvagem.

Para demonstrar a capacidade do método descrito para analisar quantitativamente efectora translocação para células alvo, duas estirpes de Yersinia com diferentes cinéticas de translocação foram estudados: Y. enterocolitica estirpe selvagem WA-314 (sorogrupo O8, o plasmídeo de virulência pYVO8 22) e seu derivado WA-314ΔYopE (WA-314 abrigar pYVO8ΔYopE 23). Trabalhos anteriores mostraram que Y. mutantes enterocolitica falta funcional exposição YopE significativamente maior taxa de translocação Yop 10. Ambas as estirpes foram transformadas com vectores que codificam para as fusões de o sinal de secreção N-terminal de YopE e TEM-1 beta-lactamase (bla-PMK) 17. WA-314 foi adicionalmente transformado com um vector que codifica para um respectivo fusão YopE ovalbumina (OVA-PMK 17) para servir como um controlo negativo. Os tempos de incubação de 30, 60 e 90 min foram aplicados a fim de avaliar ainda mais a gama eficaz de um method`snd aptidão para a quantificação. Duas leituras diferentes foram utilizados para a análise de dados: fluorescência do dador (CH1) e os coeficientes relativos de FRET (CH3 = CH 2 &#39;/ (CH1 + Ch2&#39;)) (Figura 1B e 1C). Para a estirpe de controlo negativo WA-314-PMK-óvulos trama de intensidades de canais dador (CH1) ao longo do tempo não apresenta qualquer aumento de emissão de fluorescência, independentemente de o tempo de incubação (Figura 1B). Em contraste, em células WA-314-PMK-bla infectadas foi detectado um aumento de intensidade de fluorescência ao longo do tempo, indicando a presença de YopE fusão de beta-lactamase no citoplasma da célula alvo. Como esperado, a inclinação máxima de intensidade de fluorescência é positivamente correlacionada com o comprimento da infecção (30 min de infecção: 0,10 / min, 60 min de infecção: 0,33 / min, 90 min de infecção: 0,76 / min), indicando que diferentes concentrações de beta-translocado lactamase podem ser distinguidos. De acordo com estudos anteriores WA-31Células infectadas 4ΔYopE-PMK-bla exibem aumento mais rápido da intensidade de fluorescência em comparação com a estirpe de tipo selvagem (30 min de infecção: 1,28 / min, 60 min de infecção: 1,53 / min, 90 min de infecção: 1,41 / min). Curiosamente, expandindo infecção para 90 minutos não acelerar ainda mais o aumento de fluorescência do dador em relação a 60 min de infecção (Figura 1B). Este achado pode presumivelmente ser explicado pelo efeito citotóxico progressiva exercida por WA-314ΔYopE-PMK-bla, que poderia inibir a translocação seja eficiente para além de 60 min de infecção, ou levar à perda de corantes de fluorescência devido à ruptura da integridade da membrana plasmática. Os resultados proporcionados pela utilização do coeficiente de FRET relativa (CH 3) para a análise estão em boa concordância com os resultados obtidos pelo canal doador sozinho. No entanto, em algumas condições (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 e 90 min de infecção) que representam quantidades muito grandes de translocado fusão de beta-lactamase, obviamente, o substrato era em CCF4stantly processado antes de imagem pôde ser iniciado. Estas condições não permitiria que para calcular uma inclinação negativa máximo razoável porque a parte relevante da curva é desperdiçada nessa representação de dados (Figura 1C). Imagens da relação FRET canal coeficiente de proporcionar a possibilidade de comparar as diferenças entre células individuais (Figura 1D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53115/53115fig1.jpg" /> Figura 1. A análise quantitativa de effector translocação por fusões TEM-1 YopE em Y. enterocolitica. (A) A hidrólise do substrato pela CCF4 translocado TEM-1 beta-lactamase foi monitorizada por microscopia de varrimento de laser. Excitação a 405 nm resultou em emissão de fluorescência verde (530 nm) para o substrato intacto e em azul de emissão de fluorescência (460 nm) para o PR hidrólise clivadooduct (cumarina). (B, C) ​​Microscopia dados foram analisados ​​quantitativamente, plotando a intensidade canal doador (CH1) ou cálculo e plotagem dos coeficientes relativos FRET (CH3 = CH 2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;)). Os dados são representativos de três experiências independentes. (D) representado micrografias (FRET canal) foram tomadas a partir de filmes representativos nos pontos de tempo indicados. WA-314ΔE-PMK-bla células infectadas mostram diminuição mais rápida dos coeficientes FRET relativos, em comparação com o tipo selvagem WA-314-PMK-bla (60 min infecção). Barra de escala, 20 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53115/53115fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53115/53115fig2.jpg" /> Figura 2. determinação Cross-talk do V450 fluorophores e FITC.Os espectros de ambos os fluoróforos individuais foram medidos com o microscópio confocal. A infiltração do V450 doador para o canal aceitador dentro da gama de 525-535 nm detector foi calculada a partir de uma regressão linear (inserção). A porcentagem média de crosstalk calculado a partir de duas medições é igual a 0,33. Sangrar-through do FITC receptor para o canal doador (455-465 nm) não era detectável em relação ao nível de ruído. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53115/53115fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K visualizações.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Imunologia e Infecção

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Genética

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Biologia

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host cells. Upon entry, the injected effector proteins cooperatively modulate eukaryotic signaling pathways and reprogram cellular functions, enabling bacterial entry and survival. Monitoring and localizing these secreted effector proteins in the context of infections provides a footprint for defining the dynamic interface of host-pathogen interactions. However, labeling and imaging bacterial proteins in host cells without disrupting their structure/function is technically challenging. 
Constructing fluorescent fusion proteins does not resolve this problem, because the fusion proteins jam the secretory apparatus and thus are not secreted. To overcome these obstacles, we recently employed a method for site-specific fluorescent labeling of bacterial secreted effectors, as well as other difficult-to-label proteins, using genetic code expansion (GCE). This paper provides a complete step-by-step protocol to label Salmonella secreted effectors using GCE site-specifically, followed by directions for imaging the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) 
Recent findings suggest that the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via GCE, followed by bio-orthogonal labeling with tetrazine-containing dyes, is a viable technique for selective labeling and visualization of bacterial secreted proteins and subsequent image analysis in the host. The goal of this article is to provide a straightforward and clear protocol that can be employed by investigators interested in conducting super-resolution imaging using GCE to study various biological processes in bacteria and viruses, as well as host-pathogen interactions.

This article provides a straightforward and clear protocol to label Salmonella secreted effectors using genetic code expansion (GCE) site-specifically and image the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM)

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Análises de

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Geração de

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

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Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

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A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

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