Name: modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging at JoVE.com

This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Illinois. Todos os animais foram alojados em instalações de cuidados de animais aprovados pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care. Foi feito todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados e reduzir o sofrimento em todas as fases do estudo. 1. Preparação e Remoção de cérebro de rato para Cortando <ol><li> Prepare-se para perfusão e fatia de incubação. <ol><li> Cerca de 30 minutos antes de cortar, preparar alta solução de corte de sacarose e de baixo aCSF cálcio para a incubação da fatia antes da gravação ou imagem. </li><li> Colocar para fora todas as ferramentas necessárias (grandes tesouras cegas finais, pequenas tesouras primavera, pinças anatômicas, grandes tesouras ou guilhotina, íris tesouras, joalheiros fórceps, seringa de 10 ml com agulha de 27G x 1/2 polegadas, pequeno pedaço de 1 cm x 2 cm de filtro papel, e uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para sltransferência de gelo) para perfusão e corte, e preparar a bandeja de perfusão. </li><li> Configurar câmara com oxigenado aCSF incubação num banho de água 32 o C e um prato de cultura preenchido com solução de corte. </li></ol></li><li> Prepare corte palco para cortar. <ol><li> Corte um pequeno pedaço de agar a 3%, aproximadamente, 1 cm 3 para usar como um batente para o cérebro e 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para uma colisão para ser utilizado para sustentar o IC. </li><li> Cole o batente traseiro para o palco com adesivo de cianoacrilato, bem como a saliência no lado direito do batente de tal modo que eles formam um ângulo de 80 °. </li></ol></li><li> Remover o cérebro. <ol><li> Profundamente anestesiar a p12-p20 (idealmente p14-18) mouse com cetamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (ou procedimento aprovado comitê de ética comparáveis). Nota: Confirme nível anestesia adequada através de falta de resposta aos pés pitada. À medida que o animal é brevemente sob anestesia, pomada oftálmica é desnecessária. </li><li> Usando sem cortetesoura acabar, expor a caixa torácica do apêndice xifóide até o pescoço. <ol><li> Encontre o apêndice xifóide, e faça um corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm. </li><li> Faça dois cortes verticais das extremidades do corte horizontal anterior para os ombros, aproximadamente 1,5 cm cada. </li></ol></li><li> Corte através do diafragma e as junções costocondrais para expor o coração. </li><li> Com uma tesoura pequena mola, faça um pequeno, 2-5 mm cortar no átrio direito, a partir do ventral para dorsal lado do coração. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27G x 1/2 de polegada, injectar o ventrículo esquerdo e rapidamente perfundir o animal com elevado corte solução de sacarose. </li><li> Quando o sangue corre claro, usar a tesoura maiores para remover a cabeça. Nota: Não temos sistematicamente avaliada a utilidade da perfusão. No entanto, em nossa experiência, a perfusão transcardíaca em ratinhos jovens este pode ser feito com quase 100% de sucesso, e tem a vantagem de eliminar bl vermelhoood células, o que pode interferir com fluorescência e imagem. </li><li> Corte a pele para baixo da linha média para expor o crânio. </li><li> Usando íris dobrados tesoura, corte o crânio entre os olhos, em seguida, começando a partir do corte entre os olhos, cuidadosamente cortadas de anterior para posterior ao longo da sutura mediana tomando cuidado para não danificar o cérebro por baixo. Nota: A dura geralmente sai com o crânio. Se necessário, retire a dura antes de retirar cuidadosamente o cérebro. </li><li> Usando uma pinça joalheiro, forçar a abertura do crânio e remova cuidadosamente o cérebro, em seguida, colocar o cérebro em solução de corte. Tome cuidado para não danificar o córtex. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do cérebro por Cortando <ol><li> Preparando cérebro para montagem em vibratome palco. <ol><li> Usando uma lâmina marcada com duas linhas a 90 o e uma linha diagonal em 17 o da parte superior esquerda para a direita inferior, interseção onde as duas linhas se encontram, coloque o lado do cérebro dorsal para cima, utilizandouma lâmina de barbear, de 2-4 mm de remover o cérebro extremidade rostral criando uma superfície plana. </li><li> Coloque cérebro lado do caudal sobre a superfície plana recentemente criado, e alinhar a superfície dorsal do cérebro com a horizontal e da linha média do cérebro com a linha vertical. </li><li> Alinhe a lâmina de barbear com a linha 17 o, incline a lâmina em um ângulo de 30 ° e retire cerca de 3 mm do córtex direito em um corte diagonal duplo (17 o do plano horizontal e 60 o do coronal). </li></ol></li><li> Montagem cérebro em vibratome palco. <ol><li> Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro de 1 cm x 2 cm sobre o lado ventral do cérebro, de forma que a dimensão do comprimento é perpendicular à linha mediana. </li><li> Cuidadosamente aplicar uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato para a área em frente do batente traseiro (e para a esquerda da colisão). </li><li> Coloque o cérebro diagonalmente duplo corte para a cola de modo a que a parte caudal do cérebro e do encéfalo posterior são prOP sobre a colisão eo lado direito do cérebro é contra o anti-retorno. </li><li> Delicadamente pressionar para baixo sobre o cérebro, assegurando que toda a superfície está em contacto com a câmara de corte. </li></ol></li></ol> 3. A obtenção da Colliculo-tálamo-cortical Slice <ol><li> Assumir rapidamente o estágio de corte e coloque no vibratome, encher o palco com uma solução de corte. </li><li> Alinhar a lâmina com a parte superior (lado ventral) no cérebro. </li><li> Remover 1-1,5 mm a partir do topo do cérebro, remova 300-500 uM fatias e avaliar profundidade após a remoção. Nota: Quando o IC, o MGB, eo núcleo geniculado lateral (LGN) são visíveis, eo giro dentado forma uma forma &#39;C&#39; levar de um a dois 600 um fatias. Ver a Figura 3A. </li><li> Coloque as fatias em câmara quente (32 ° C), segurando. </li></ol> 4. Criação de Imagens do Slice <ol><li> Preparação para a imagem latente flavoprotein autofluorescência. <ol> &lt;li&gt; Preparar aCSF pela perfusão da fatia numa câmara de registo electrofisiológico padrão, bolha aCSF com 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Puxe eletrodo de vidro para a estimulação. Observe que vários eletrodos estimulantes diferentes e configurações (vidro, tungsténio, fibra de carbono, monopolar, bipolar) todo o trabalho muito bem em conjunto com imagiologia flavoprotein autofluorescência. </li><li> Ligue computador, câmera, micromanipulador, fonte de luz, estimulação software, software de captura de imagem. </li><li> Perfundir a câmara de gravação com oxigenado aCSF, coloque ponte personalizado (projeto disponível em Materiais Complementares) para elevar a fatia na câmara. Nota: taxa de perfusão pode variar de acordo com qualquer indivíduo configurar; 5-15 mL / min é usada aqui. </li><li> Coloque fatia na câmara, diminuir o nível de líquido na câmara para evitar que a fatia de levantar fora da ponte ao colocar harpa especialmente construído sobre fatia, tendo o cuidado de evitar a colocação de cordas da harpa sobre as vias de cooperação interEst (Figura 1A). Aumentar o nível de líquido para cerca de 1-2 mm acima da fatia para manter o fluxo aCSF acima e abaixo da fatia. Nota: Se o reposicionamento é necessário, use o fim Pasteur pipeta quebrado ou permitir que o nível aCSF a subir e utilize uma pinça com extremo cuidado. </li><li> Inserir eletrodos de cloreto de prata em eletrodo de vidro cheio de aCSF, insira o eletrodo de vidro em micromanipulador e conectar-se ao estímulo isolador, e coloque cuidadosamente eletrodo de vidro no IC / substância branca levando a tálamo (ver Figura 1A). </li></ol></li><li> Flavoproteína aquisição de imagem autofluorescência. <ol><li> Coletar imagens em 4 Hz (usando uma macro 2X objetivo corrigido ao infinito (NA 0,13)) e uma câmera para 105 seg enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de 1 seg de 40 Hz 2 ms pulsos tecido em 0,05 Hz cinco vezes), enquanto iluminando o tecido com luz azul 470-490 nm e 515 nm capturar acima. Certifique-se de que a imagem não é nem aVeja o escuro, nem apagado Figura 3 coluna esquerda para referência. Nota: Coleção tempo, frequência de recolha, e freqüência de estimulação pode ser alterado para se adequar ao experimento, o programa personalizado incluído no materiais complementares podem ser modificados como tal. </li><li> Exportar imagens para Matlab, e utilizando o programa de escrita feito sob encomenda disponível em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0,05 Hz. A imagem resultante mostrará vias conectados. Nota: O programa personalizado usa uma transformação Fourier rápida dos valores de pixel da série histórica para produzir a imagem. </li></ol></li><li> Preparação para a imagiologia de cálcio. <ol><li> Prepare pequena câmara de incubação utilizando um prato de cultura de 3 cm e membrana cultura levantada para permitir aCSF para alcançar a parte superior e inferior da fatia, e lugar numa almofada de aquecimento para manter a temperatura a cerca de 32 o C. </li><li> Preencha pequena câmara de incubação com aCSF morna e lentamente bolha com 95% O2/5% de CO 2. </li><li> Misturar 2 ul de Pluronic F-127 de ácido e 50 ug de Fura-02:00 dissolvido em 48 ul de DMSO. </li><li> Lugar em fatia pequena câmara de incubação na membrana levantou e cuidadosamente usando uma micropipeta adicione a mistura de coloração diretamente acima do MGB (ou outra estrutura de interesse). </li><li> Cubra fatias para prevenir o branqueamento antes da imagiologia, e permitem fatias a incubar durante 45 minutos - 1 hora. </li><li> Retire as fatias a câmara de retenção aquecida para 10-15 minutos para lavar o excesso de material. </li><li> Siga os passos 4.1.1 a 4.1.6 para preparação de estimular e imagem da fatia colliculo-tálamo-cortical. </li></ol></li><li> Aquisição de imagem de cálcio. <ol><li> Coletar imagens em 10 Hz (utilizando uma objectiva de imersão 20X de água) por 25 segundos enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de um pulso de 2 ms) tecido a 0,2 Hz cinco vezes enquanto iluminando o tecido com 365 nm de luz e capturando fluorescência acima de 510 nm. </li&gt; <li> Exportar imagens para Matlab e usar o programa escrito costume disponíveis em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0.2 Hz. A imagem resultante mostrará células activas. </li></ol></li></ol>

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	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. 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The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to our previous work1, which increase the yield of connected slices. These modifications include a slightly different cutting angle in the horizontal plane 17o compared to 20o, an added angle in the coronal plane, 60o from coronal and a smaller bump under the IC 1.5 mm compared to 2 mm. While small, these modifications greatly improve the yield and reliability of the method, with practice slices should be obtained 80-100% of the time. Along with obtaining the colliculo-thalamocortical slice, the protocol also describes rapid assessment of the connectivity of the slice ensuring that the slice is connected before further experimentation is done. With the enhanced reliability of the slice, it will be easier to use in conjunction with disease models to understand changes in the auditory system in the diseased state.
There are a few critical steps to optimize obtaining the colliculo-thalamocortical slice. While it is possible to use mice from postnatal day 12 through postnatal day 22, the highest rates of obtaining full connectivity in the slice are between postnatal day 14 and 18. Another critical step is rapid removal of the mouse brain, this will help ensure the health of the tissue providing for a better experiment. After removing the brain from the mouse and removing the frontal cortex, the double angled cut is the most critical step; a clean, fluid motion of the cut as well as maintaining the appropriate angles is necessary to align the appropriate brain structures. If the angled cuts are performed incorrectly, it is likely the connections from the MGB to the AC will not be maintained. If the 17 o angled cut is off by more than a few degrees, the connections from the IC to the MGB will be lost as well. Similarly, if the step underneath the IC is too large, the IC and MGB will be out of alignment. Using flavoprotein autofluorescence imaging, it is easy to quickly determine slice connectivity. If the slice is not fully connected, the stimulator can be moved around the slice to quickly determine which parts of the slice are connected so corrections can be made in future experiments. 
While this slice provides a method to explore information flow through the auditory system, there are some limitations. One of the major strengths of this method is the control of inputs to the nuclei of study, however many connections are severed in the slice. The functions are more complex in vivo so the modeling of this system would be incomplete. Similarly, the stimulation paradigms currently available will be different than the signals generated from sensory perception. Though these limitations are inherent in this in vitro system, the preparation is useful to understand information flow in the auditory system. Though onset of hearing in mice is approximately p1212,13the central auditory system is not yet fully developed at the time that these slices are prepared. This lack of full maturity of these slices may limit the generalizability of the findings derived from this slice.
The use of three-dimensional printing for specialized hardware for preserving and maintaining the slice's connections allows the experimenter to customize these pieces to their needs. Advances in three-dimensional printing allow for a highly customizable set of harps and bridges using materials better suited for placement of strings to hold down the slice at more precise tensions as well as holding up the slice and allowing for better fluid perfusion. These designs are easily customizable to the individual setup without the need for expensive or difficult to make pieces of equipment.

No sistema auditivo, embora não haja processamento substancial de informação entre a periferia sensorial e colículo inferior, existe uma considerável processamento adicional antes que ela atinja o córtex auditivo. Sabemos muito pouco sobre como esse processamento é feito e, portanto, pouco sobre como essa transformação permite que o cérebro para interpretar informação sensorial recebida. Com a excepção do olfacto, cada um dos sentidos tem uma estrutura muito semelhante com sinais periféricos inicialmente ser retransmitido com alta fidelidade, que diminui à medida que o sinal sobe para o córtex. O córtex, em seguida, envia projecções para as estruturas inferiores para modular ainda mais a informação recebida. Este sistema complexo tem sido estudada numa variedade de maneiras in vivo, bem como em um número de preparações in vitro. No primeiro caso, todas as ligações estão intactas, permitindo que o pesquisador sondar qualquer conjunto de ligações, enquanto se controla a entrada sensorial e medindosaída em qualquer área. Com essa abordagem, há pouco ou nenhum controlo da grande variedade de outros factores de produção, incluindo outras entradas sensoriais, excitação e atenção, dando origem a uma produção intensamente complexo. In vitro, fatias de cérebro foram cortados para capturar um único set de projecções, ou duas áreas do cérebro ligadas, que permitem que pesquisadores para estimular e avaliar vários aferentes ou áreas do cérebro. Estes são muitas vezes fatias quer talamocorticais ou tectothalamic onde quer a entrada para o tálamo ou no tálamo e sua saída para o córtex são preservados 2-5. Estas preparações permitem uma ampla variedade de manipulações farmacológicas, elétricas e optogenética. No entanto, com apenas duas regiões do cérebro, que avaliam principalmente à transferência de informações e falta a capacidade de avaliar a transformação de informação à medida que passa através do tálamo. Além disso, a projecção reticulo-tálamo, o que pode jogar um papel na modulação da atenção é 6-9 PRESENT nesta fatia. Aqui demonstramos melhorias sobre nossa preparação anterior 1, que permite o controle investigador de várias entradas para o tálamo para dar uma perspectiva única de como os portões tálamo e filtros de informação. Nós casal Esta preparação fatia romance com imagens flavoprotein autofluorescência para avaliar a conectividade fatia e análise de ativação de grande escala, a imagem latente de cálcio no tálamo para análise da população neuronal, e gravação de uma única célula para medir o impacto das várias entradas em um nível única célula. Para auxiliar na manutenção destas ligações generalizadas nós também têm desenvolvido uma série de modificações do âncora fatia normal (aka &quot;harpa&quot;) para a realização da fatia do cérebro no lugar e uma ponte para elevar a fatia para maior perfusão. A harpa é projetado em forma de ferradura modificado para cercar a fatia e permitir a pontos de fixação personalizáveis ​​para as cordas da harpa. Três cordas sãoligado de tal modo que i) um encontra-se horizontalmente ao longo do bordo medial da fatia, ii) estende-se a partir da extremidade caudal do IC para a extremidade caudal do CA e iii) estende-se na diagonal a partir do bordo medial da fatia para uma área rostral à AC (ver Figura 1A). Pequenos recortes no quadro para colagem (com cola de cianoacrilato) de harpas cordas para permitir uma diminuição da quantidade de pressão sobre a fatia para ajudar a manter a integridade da fatia (ver Figura 1B). Ao usar a impressão tridimensional, somos capazes de harpas de design personalizado com as nossas especificações únicas, bem como pontes que permitem o fluxo ideal de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) acima e abaixo do tecido. Isso também mantém grandes áreas para a luz para penetrar no tecido para patch-clamp eletrofisiologia.

<table><tbody><tr><td>High sucrose cutting solution</td><td></td><td></td><td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 11.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Low calcium aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>Large culture dish</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm culture dish</td></tr><tr><td>Small culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm culture dish</td></tr><tr><td>Raised culture membrane</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td></tr><tr><td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&amp;ndash;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&amp;nbsp; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td></tr><tr><td>Calcium imaging fluorescence cube</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission</td></tr><tr><td>Agar for blocking brain</td><td></td><td></td><td>3% by weight in water</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Um exemplo de fatia de cérebro de ratinho colliculo-talamocortical obtido em P15 rato é mostrada na Figura 2. A fatia ideal irá conter os quatro principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo IC, MGB, TRN, e AC, que são activados quando o IC é estimulada (Figura 2A). Usando a análise de Fourier, o poder espectral é medido na frequência de estimulação elétrica, com regiões do cérebro ligadas mostrando atividade que é periódica e arrastado na freqüência de estimulação 10. Este protocolo permite o estudo de fluxo ascendente de informações em particular no tálamo como um nexo entre o mesencéfalo e do córtex. Enquanto esta ajudas de protocolo na produção da fatia colliculo-tálamo-cortical conectado, bem como proporcionar um conjunto mais facilmente personalizável de hardware com a incorporação de impressão 3D, incluídos são um exemplo de uma fatia não conectado a partir do tálamo ao córtex (Figura 2B ), uma<html> s bem como um padrão de ligação em que o tálamo não apresenta actividade com autofluorescência flavoproteína imagiologia (Figura 2C). Isto é provavelmente devido à ligação interna sendo a fatia de tal modo que a activação não está na superfície da fatia e, portanto, incapaz de ser visto com a imagiologia flavoproteína autofluorescência. É possível, embora improvável que esta é a ativação antidrômica. Nós não vimos ativação antidrômica ao estimular a matéria branca das projeções tálamo-11, e com este paradigma estimulação sináptica bloqueio no tálamo causa uma eliminação reversível do sinal cortical 1. Usando esta fatia, é também possível observar a actividade população de células no tálamo com estimulação eléctrica do IC. Uma experiência de imagem de cálcio exemplo mostra a actividade de cravação de uma pequena população de neurónios talâmicos em resposta a um estímulo mesencéfalo (Figura 3). <html> ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53067/53067fig1.jpg" /> Figura 1. Prestação de materiais impressos 3D. (A) Imagem rendida da fatia sentado na ponte com a harpa impresso no lugar. A seta indica o fluxo de aCSF. (B) Imagem rendida destacando ranhuras para as cordas da harpa que permitam a fatia mais grossa (círculos). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53067/53067fig2.jpg" /> Figura 2. Corte o cérebro para corte. (A) Agar posicionamento no palco de corte. (B) Deslize para o posicionamento cérebro. (C) Posição do cérebro para o corte anterior. (D) Posição do cérebro e navalha para corte em ângulo de casal. (E) de bloqueio Final do cérebro para corte . <html> /ftp_upload/53067/53067fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. flavoproteína autofluorescência de imagem da fatia do cérebro colliculo-tálamo-cortical. (A) Conectado fatia do cérebro colliculo-tálamo-cortical como confirmado por flavoproteína autofluorescência. A estimulação elétrica em 0,05 Hz de IC fotografada a 4 Hz e Fourier processada para mostrar o poder na freqüência de estimulação. Nota activação do MGB, e TRN, CA, assim como o corpo estriado (CS). (B) não conectada fatia. A estimulação elétrica de IC com apenas ativação do MGB. Via inteira não foi capturado provavelmente devido a 17 o ângulo é um pouco demasiado íngreme. (C) activação atípica de AC. A estimulação elétrica de IC com a ativação de AC sem sinal visível no MGB ou TRN. Caminho provavelmente intacta no entanto as células activas do MGB são susceptíveis no outro lado do tecido. ad / 53067 / 53067fig4.jpg &quot;/&gt; Imagem Raw 20X do MGB Figura de imagem 4. O cálcio. (A) imagem crua de exemplo fatia iluminado para geração de imagens de cálcio. (B), pontos brilhantes são células. Barra de escala de 100 um. (C) sinal de cálcio com a estimulação elétrica do IC. Processamento de Fourier mostra ativação de ambas as células setas brancas e ponta de seta preta neuropil. Inset, curso de tempo do sinal de média (barra de escala inserir mudança de 0,5% na fluorescência, 1 seg).

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K visualizações.  University of Illinois Urbana-Champaign.  O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas. 

Vídeo: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Neurociência

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Imagem de cálcio de dois fótons e campo amplo no colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor em destaque: Revelando a codificação neural e os mecanismos de processamento visual no colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

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Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Multi-layer Cortical Ca

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos