Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

Os animais foram mantidos no Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, de Berlim, Alemanha), e todos os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Secretaria de Estado da Saúde e Assuntos Locais (LAGeSo, Berlim, Alemanha; Reg. No. 0365 O / 11). Colheita 1. Fígado <ol><li> Preparação pré-cirúrgica <ol><li> Use uma placa de cortiça para fixação. Coloque uma cortina médico sobre a placa. Usando quatro agulhas, fixar uma máscara de inalação na placa de cortiça para narcose intraoperatória inalação. </li></ol></li><li> Prearrangement do Portal venosa cânula <ol><li> Conecte-se um cateter venoso periférico (G 20) a uma torneira de três vias. O cateter venoso deve ser cortado obliquamente, com um comprimento de aprox. 1,5 cm. </li><li> De-ar do sistema usando uma seringa de 10 ml cheia com solução de Ringer. É muito importante para cuidadosamente-air de embolia gasosa, porque pode afetar negativamente o decellularization perfusão. </li></ol></li><li> Prearrangementda cânula arterial <ol><li> Usar uma cânula borboleta e cortar a agulha com um comprimento de 5 mm. Instale um tubo de 5 centímetros (ID 0,58 milímetros; OD 0,96 milímetros) para a agulha 5 mm e corrigi-lo com supercola. Inserir um tubo 2 cm de comprimento (ID 0,28 milímetros; OD 0,61 milímetros) para dentro do tubo maior e corrigi-lo com supercola. </li><li> Deslizamento outro tubo sobre essa construção como um pilar e corrigi-lo com supercola. De-ar da cânula arterial com uma seringa de 5 ml cheio com solução de Ringer. </li></ol></li><li> Anestesia e Analgesia <ol><li> Induzir narcose do rato na câmara de indução da anestesia de 3,5% de isoflurano em oxigénio a um caudal de 1,5 L / min. </li><li> Para assegurar a analgesia segura durante a operação, metamizol injectar (100 mg / kg de massa corporal) e a cetamina em dose baixa / medetomidina (10 mg / 0,1 mg por kg de massa corporal) por via intraperitoneal. </li><li> Fornecer 1,5% de isoflurano em 1 L / min de oxigênio via máscara de inalação para posterior manutenção da anestesia cirúrgica. </li></ol></li><li> Arranjos pré-operatórios &lt;ol&gt; <li> Raspar o abdômen liberalmente com uma máquina de corte elétrica. Humedecer o local da incisão no abdómen rapado com etanol a 70% para desinfecção. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal sobre a placa preparado, insira a cabeça para dentro da máscara de inalação e corrigir os membros com fita adesiva médica e pinos. Retire o excesso de etanol e de pele com uma compressa de gaze. </li></ol></li><li> Avaliação anestesia <ol><li> Avaliar a profundidade da anestesia, observando a freqüência respiratória. Quando a anestesia parece suficientemente profundo (40-60 respirações / min), verifique se a analgesia é suficiente, tentando provocar o reflexo toe pitada usando uma pinça cirúrgica para comprimir a pele entre os dedos de ambas as patas traseiras. </li></ol></li><li> Abordagem abdominal <ol><li> Adicione uma incisão mediana na parede abdominal caudal acima da bexiga. Cortar a partir deste ponto para ambos os arcos hipocôndrios de uma maneira em forma de V. Tome cuidado para não cortar o diafragma. Puxe a parede abdominal corte sobre o peito. </li&gt; <li> Fixar o xifóide com uma braçadeira Overholt, puxe-cranial e corrigi-lo com um elástico. Use cotonetes molhados para evacuar o intestino. Enrole intestino em uma atadura de gaze molhada. Além disso, cobrir todas as margens abdominais com compressas húmidas. </li></ol></li><li> Preparação fígado <ol><li> Dissecar o ligamento falciforme. Use uma atadura de gaze molhada para manter os lobos hepáticos medial e cranial esquerda sob a cúpula do diafragma. Expor o ligamento hepatoduodenal eo lóbulo do fígado omental superior. </li><li> Use duas micropinças e tesoura primavera para dissecar cuidadosamente o ligamento anexado ao lobo omental superior até que o lobo é móvel. Mova o lobo usando cotonetes molhados sob a compressa de gaze, segurando os lobos medial e deixados no local. </li><li> Depois de mobilização do lóbulo do fígado omental superior, passar do estômago para a esquerda. Fixar o estômago com uma braçadeira e dissecar o omento menor com micropinças e os tesoura primavera. </li><li> Mobilizar a omentos menorl lóbulo do fígado até que ele é móvel e, posteriormente, mover o lobo de volta em sua cavidade. Usar uma braçadeira Backhaus para reter o duodeno. Mover o duodeno para a esquerda para esticar e expor o ligamento hepatoduodenal. Circunscrever o ducto biliar comum no ligamento hepatoduodenal esticado. </li><li> Dissecar o ducto biliar do tecido adiposo e no pâncreas. Corte o ducto biliar 1,5 cm do bifurcação do ducto biliar. Dissecar a veia porta a partir do tecido adiposo circundante. Expor a veia gastroduodenal. </li><li> Ligadura da veia gastroduodenal duas vezes com seda 6-0 e dividir a veia entre as duas ligaduras. Dissecar o tronco celíaco e da artéria hepática comum do tecido circundante até que todos rami arterial são revelados. </li><li> Libertar a artéria gastroduodenal a partir do tecido circundante. Ate a artéria gastroduodenal duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes um do outro. Dissecção da artéria gastroduodenal entre as duas ligaduras. </li><li> Libere a artéria esplênicaa partir do tecido circundante. Amarre a artéria esplênica duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria esplênica entre as duas ligaduras. </li><li> Libertar a artéria gástrica esquerda a partir do tecido circundante. Amarre a artéria gástrica esquerda duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria entre as duas ligaduras. </li><li> Circunscrever a veia cava inferior entre o rim direito e no lobo hepático lateral direito. Dissecar a veia do espaço retroperitoneal. Expor a aorta, seguindo o tronco celíaco. </li><li> Dissecar o tecido adiposo retroperitoneal. Injectar 1000 IE de heparina em 1 ml de solução salina na veia cava inferior. Retrair a cânula e fechar a incisão com um algodão. Espera 1-2 min para o efeito sistémico de heparina. </li><li> Circunscrever a aorta com uma pinça. Dissecar a aorta e desangrar o rato. Além disso, dissecar a veia cava inferior distalmente a partir do rim. </li></ol></li><li> Portal venoso Canulação (Use a cânula preparada na secção 1.2) <ol><li> Faça uma incisão na boca peixe na veia portal distal. Abra a incisão com uma pinça e canular a veia porta. Lave o fígado com 20 ml de solução de Ringer até os descolore fígado e fixar a cânula com ligaduras de seda (6-0). </li></ol></li><li> A canulação arterial (Use a cânula preparada no ponto 1.3) <ol><li> Dissecar a aorta acima do tronco celíaco. Libere o segmento de aorta a partir do espaço retroperitoneal. Corte o segmento de aorta longitudinalmente para gerar um remendo aórtico. Insira a cânula auto-construído em um suporte estático. </li><li> Use uma pinça para deslizar 2 a correção da aorta através da cânula. Ligadura da artéria hepática com seda 6-0 sobre a cânula e corrigir o patch no pilar. </li></ol></li><li> Explantation fígado <ol><li> Abra o diafragma, fazer uma incisão circular e dissecar o fígado a partir das estruturas circundantes. </li></ol></li><li> Armazenamento <ol><li> Store o fígado num tanque estéril de 500 ml cheio com 350 ml de solução de Ringer até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 2. As soluções de detergentes <ol><li> Solução Triton X-100 estoque 10% <ol><li> Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adiciona-se 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Usar um agitador para dissolver o Triton X-100. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido. </li></ol></li><li> 1% de Triton X-100 <ol><li> Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) a um frasco de 1000 ml. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução a 1% de Triton X-100 através de um filtro estéril. </li></ol></li><li> SDS a 10% da Solução <ol><li> Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adicionar 66,99 g de SDS (99,9%, densidade 0,67). Usar um agitador para dissolver o SDS. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido. </li></ol></li><li> SDS a 1% <ol><li> Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) de um bot de 1000 mlTLE. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução de SDS a 1%, através de um filtro estéril. </li></ol></li></ol> 3. Decelularização <ol><li> Set-up de Perfusão Dispositivo <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figura 1:. Esquema do aparelho de perfusão para a Seletiva Arterial e Venoso Portal Perfusão de quatro fígados de rato sob oscilantes Condições Pressão (. Modificado a partir Struecker et al 14) <ol><li> Vincular o dreno para uma torneira de três vias e uma extensão Heidelberger para regular o nível de preenchimento e preencha o reactor com 500 ml de NaCl 0,9%. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figura 2:. Esquema da perfusão set-up Ligar a câmara de perfusão (1,400 centímetros 3) (1) à extremidade distai (4) do borbulhador (5) através do acesso venoso portal (2) ou por meio da ac arterialcesso (3). O borbulhador (5) deve ser equipado com uma obturação (4), na extremidade distai e uma abertura (6). Ligue o borbulhador (5) para uma extensão de Heidelberger (7). Ligar a extensão Heidelberger para o segmento de bomba (8). Além disso, ligar o segmento de bomba (8) para o outro ramal de Heidelberger (9). Inserir a última extensão Heidelberger (9) para dentro do frasco de detergente (10). Ligue o respirador (11) para a câmara de perfusão (ou para o distribuidor de pressão no caso de múltiplas perfusões). Para drenar os fluidos do reator, conecte a saída para o frasco de resíduos (12). <ol><li> Inserir o segmento de bomba para dentro da bomba. Iniciar a bomba para encher o ciclo com PBS, fechar a extremidade distal do borbulhador e abrir o respiradouro. Quando o fundo da bolha está firmemente coberto com PBS (03/02 centímetros), a fechar a abertura e abrir a extremidade distal do borbulhador. </li><li> Instalação de fígado <ol><li> Ligar a torneira de três vias da cânula da veia porta para o reactor de acesso relacionados. CONECTE da cânula arterial para o acesso arterial. Tenha cuidado para garantir que nenhum ar entra nos sistemas. </li></ol></li><li> Aplicação de oscilantes Condições Pressão <ol><li> Use uma máscara com uma frequência de 15 bpm e uma amplitude de 26 mbar (min. 4 mbar, 30 max. Mbar). Ligue o respirador para a câmara de distribuição de pressão e ligar a câmara ao reactor. Iniciar a aplicação de pressão. </li></ol></li><li> Decelularização Protocolo <ol><li> Execute as etapas de perfusão com um caudal de 5 ml / min. Iniciar a descelularização com a perfusão do fígado com 1% de Triton X-100 durante 90 min. Permitir effluence resíduos através do fluxo de saída do dispositivo de perfusão para manter o nível do fluido no interior da câmara de perfusão e constante sobre o fígado perfundido. Após 90 min, alterar o detergente a 1% de SDS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figura 3: Protocolo de Perfusão para todos os grupos experimentais.

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	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. 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The authors have nothing to disclose.

Embora a técnica apresentada para a colheita de fígado de rato e descelularização é facilmente reprodutível, existem certos passos críticos a serem considerados: Durante a preparação para a colheita do fígado, é importante para evitar o sangramento grave, porque ele vai activar a coagulação do sangue e podem conduzir à formação de coágulos sanguíneos dentro do fígado. Em nossa opinião, é vantajoso entalhar a aorta abdominal directamente antes da canulação da veia porta, para evitar fluxo de sangue através da artéria hepática durante a perfusão através da veia porta. Uma vez que o fígado é canulada e claramente perfusão, a formação de coágulos de sangue não é mais um problema. Após a colheita do fígado e o transporte para o aparelho de perfusão, a ligação de fígados para o aparelho de perfusão é um passo particularmente importante porque a entrada de bolhas de gás para dentro do círculo perfusão deve ser evitada para evitar a embolia gasosa. É útil para prefill a válvula de três vias, que is ligado à cânula do fígado, com PBS utilizando uma seringa e uma fina cânula directamente antes de ligar a válvula ao sistema de perfusão. Após a perfusão for estabelecida, se todos os conectores do tubo, de três vias válvulas e tubos são perfeitamente conectado deve ser re-marcada. Se os fígados foram perfundidos durante períodos de tempo mais longos (por ex., S / N), até mesmo um pequeno erro de ligação pode conduzir a sifonagem ar no sistema de perfusão, conduzindo assim a perfusão resultados fatais. Os dados apresentados são limitadas pelo fato de que a pressão óptima e a frequência de mudanças de pressão oscilante para os melhores resultados de decelularização permanecem obscuros. Além disso, a perfusão com pressão controlada pode levar a resultados melhores e mais estáveis ​​do que a perfusão de controle de fluxo faz. Perfusão com pressão controlada permite a aplicação de um protocolo de perfusão aos fígados de diferentes tamanhos e pesos, com o mesmo resultado, porque o fluxo será automaticamente be adaptada. A artéria hepática e na veia porta são significativamente diferentes em termos de tamanho e taxas de fluxo fisiológicas. Assim, uma taxa de perfusão constante (5 ml / min) irá certamente resultar em diferentes pressões de perfusão nos dois sistemas vasculares. Da mesma forma, uma pressão de perfusão constante resultará em diferentes taxas de perfusão. Um método para comparar a eficácia de descelularização através das duas vias de perfusão seria realizar perfusão a pressão de perfusão fisiológicas ou taxas de perfusão através de ambas as vias. No entanto, para tornar os resultados comparáveis ​​no presente estudo, optamos por uma taxa de perfusão constante para ambas as vias. Infelizmente, usando o nosso dispositivo, não fomos capazes de medir a pressão de perfusão dentro de fígados perfundidos. Nossos dispositivos de perfusão de próxima geração serão menores para minimizar a quantidade de material necessário perfusão. Além disso, dispositivos de bomba vai permitir perfusão com pressão controlada. ºe apresentado técnica parece muito útil para reprodutível, homogênea decellularization fígado de rato. Se a técnica apresentada é apropriado para recelularização e maturação in vitro de órgãos tem de ser aprofundadas. Se as condições de pressão oscilante tem um impacto sobre as células repopulated será um objecto de outras experiências. A técnica apresentada é mais sofisticado do que outros dispositivos de perfusão de fígado de rato e mostra várias vantagens: 1) A descelularização homogênea é reprodutível, com bons resultados quando são aplicados oscilantes condições de pressão. 2) O aparelho de perfusão é selada e permite descelularização estéril, que é um pré-requisito para o repovoamento da matriz e perfusão a longo prazo. 3) O protocolo apresentado é mais curta do que outros protocolos publicados mas ainda é muito eficaz. 4) perfusão selectiva da veia porta e da artéria hepática torna repovoamento celular selectiva através de sistemas diferentes possíveis,que pode ser uma ferramenta importante. O dispositivo de perfusão será aplicada em novos experimentos de decelularização para refinar e otimizar rato decellularization fígado. O efeito de perfusão com pressão controlada irá ser experimentalmente avaliada e comparada com a perfusão de fluxo controlada. A adição de outros elementos (por exemplo., Uma &quot;unidade de diálise&quot;, um trocador de calor, um oxigenador) para repovoamento, cultura e experiências de maturação parece possível e razoável para desenvolver ainda mais o dispositivo apresentado.

Descelularização e recelularização pode permitir a geração de órgãos funcionais, transplantáveis ​​in vitro 1. Ao remover as células e material antigénico (por exemplo., ADN, epítopos alfa-Gal) de um órgão, a matriz extracelular ou menos não-imunogénico (ECM) pode ser obtido. Esta matriz conserva a microanatomy tridimensional de um órgão e podem servir como a biomatriz ideal para o repovoamento com células de uma origem diferente, possivelmente xenogénico 2. Assim, uma matriz de fígado de rato descelularizado poderia ser repovoada com células de fígado humano. Este micro-fígado humanizado poderia servir como um modelo ex vivo para a pesquisa sobre doenças (por exemplo., Doenças metabólicas, doenças virais inatos ou neoplasias) ou para testes pré-clínicos farmacêutica 3. Vários protocolos diferentes para perfusão de fígado de rato decellularization já foram publicados 4-13. Em todos os protocolos, decellularção foi conseguida por perfusão de detergentes iónicos ou não-iónicos alcalinas através da veia portal canulada. Para o melhor de nosso conhecimento, fomos o primeiro grupo a relatar rato decellularization fígado por perfusão seletiva através da veia portal e / ou o rato artéria hepática 14. Activar a perfusão selectiva dos diferentes sistemas vasculares no fígado pode permitir melhores resultados decelularização e, além disso, podem desempenhar um papel importante no repovoamento celular. No estudo detalhado aqui, fígados foram perfundidos em um dispositivo de perfusão proprietária feitos sob medida, permitindo a perfusão sob condições de pressão oscilantes. Estas condições de pressão imitar a perfusão fisiológica respiratória dependente do fígado: in situ, o fígado paira sob a cópula do diafragma, cujo movimento durante a respiração tem um impacto direto sobre a perfusão hepática. Inspiração conduz especificamente a redução do diafragma e apertando do fígado, optimizandosaída hepato-venoso, enquanto que leva a expiração do fígado elevação e abaixamento da pressão intra-abdominal para optimizar o fluxo venoso portal-15. O nosso objectivo foi avaliar se a condições de pressão oscilante tem um impacto sobre a homogeneidade de fígado de rato descelularização perfusão intra-abdominais, imitando as condições ex vivo. A homogeneidade do processo de descelularização pode ser um fator subestimado na perfusão descelularização. Todos os agentes conhecidos utilizado para a descelularização fígado provocam alterações nas ECM. Células em áreas mal perfundidos permanecer dentro da ECM, ao passo que outras áreas já estão completamente descelularizados. Para se dissolver as células restantes, a duração ou a pressão de perfusão deve ser elevada, fazendo com que mais alterações às áreas bem perfundidos. Assim, detergentes para a descelularização deve ser distribuído de forma homogénea dentro do órgão.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

A homogeneidade e, assim, a eficácia de diferentes protocolos de decelularização foram avaliadas por observação macroscópica, análise histológica e análise do conteúdo de ADN permanecendo dentro do fígado descelularizados matrizes. Além disso, a carcaça corrosão foi realizada para visualizar a microanatomia intacta de fígados após a descelularização. Macroscopia Durante decellularization, fígados tornar Lucent, indicando a remoção de conteúdo celular. Fígados perfundidos através da veia porta mostrou elucidação não homogéneo (e, portanto, a descelularização), com células restantes macroscopicamente visíveis durante e após a descelularização (setas brancas). Fígados perfundidos pela artéria hepática mostrou um curso decellularization mais homogênea e não há células restantes visíveis. Se os fígados foram perfundidos com a aplicação de condições de pressão oscilante, não há células restantes eram visíveis, independentemente da via de perfusão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> Figura 4: Os resultados macroscópicos de Rat Liver Decelularização sem oscilante Condições Pressão. Esquerda: de fígado de rato descelularizados através da artéria hepática. O fígado aparece Lucent, sem células restantes macroscopicamente visíveis. Direita: fígado perfundido através da veia porta. O fígado parece não homogeneamente descelularizados, com células macroscopicamente visível <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig5.jpg" /> Figura 5: resultados macroscópicos de rato decellularization fígado sob condições de pressão oscilantes. Esquerda: de fígado de rato descelularizados através da artéria hepática. Direita: fígado perfundido através da veia porta. Ambos os fígados aparecer Lucent, sem células restantes visíveis. A avaliação histológica A avaliação histológica de descelularizados apoio matrizes de fígadoed os achados macroscópicos. Os fígados per fundidos através da artéria hepática não apresentaram células restantes, independentemente do facto de os ratos foram perfundidos sob condições de pressão oscilante. Fígados perfundidos através da veia porta mostrou zonas de células restantes, mesmo se eles foram perfundidos com a aplicação de condições de pressão oscilante. No entanto, a aplicação de condições de pressão reduzida de oscilação da massa de células remanescente em fígados perfundidos através da veia porta. O ECM dos fígados foi conservada, sem diferenças visíveis em todos os protocolos aplicados. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig6.jpg" /> Figura 6: H / E Coloração de descelularizados fígado Matrizes. AP: matriz fígado descelularizado perfundido através da artéria hepática, sem condições de pressão oscilante. A + P: matriz fígado decelularizado perfundido através da artéria hepática em condições de pressão oscilantes. PA-P: fígado decelularizado matrix perfundidos através da veia porta, sem condições de pressão oscilante. PA + P: matriz fígado descelularizado perfundidos através da veia porta, em condições de pressão oscilante. Setas: Restantes grupos de células. Teor de ADN O conteúdo de DNA por peso seco de matriz fígado diminuiu em todos os grupos experimentais em comparação com a de fígado nativo, embora as diferenças só foram estatisticamente significativa nos grupos perfundidos em condições de oscilação de pressão (PV + P; A + P). A menor quantidade de DNA por peso seco foi encontrada nos fígados perfundidos pela artéria hepática sob oscilantes condições de pressão. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig7.jpg" /> Figura 7: Conteúdo DNA Per seco Peso de fígado Matrix (modificado de Struecker et al 14.). Fígados descelularizados via o show artéria hepática menos restante DNA do que os orvalhard através do portal veia fazer. Fígados perfundidos sob condições de pressão oscilantes mostrar DNA menos do que os restantes descelularizados sem essas condições fazem. Assim, os fígados per fundidos através da artéria hepática sob condições de pressão oscilante mostrar o conteúdo mínimo de ADN restante. Corrosão Fundição Fundição por corrosão de matrizes de fígado descelularizados confirmou que o microanatomy de fígados (incluindo a estrutura da proteína do sistema venoso portal, o sistema arterial e do sistema biliar) é conservada durante descelularização. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig8.jpg" /> Figura 8: Fotografia de uma fundição por corrosão de um Rat Liver Matrix Descelularizados (modificado a partir Struecker et al 14.). Apesar de a remoção de todas as células, a microanatomia do órgão, incluindo a veia porta (azul) e sistemas arteriais (vermelho), são conservados. A remaining principais ramos do sistema biliar são fundidos em amarelo. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /> Tabela 1: Grupos experimentais para avaliar o efeito das oscilantes condições de pressão e a via de perfusão em Rat Liver Decelularização.

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Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Bioengenharia

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Bioquímica

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Engenharia

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biologia

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Medicina

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...