Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

Die Tiere wurden nach der Fazilität für Experimentelle Medizin (FEM, Charité, Berlin, Deutschland) gehalten wird, und alle Versuchsprotokolle wurden überprüft und durch das Landesamt für Gesundheit und lokale Angelegenheiten (LAGeSo, Berlin, Deutschland zugelassen; Reg. No. O 0365 / 11). 1. Liver Harvesting <ol><li> Präoperative Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine Korkplatte zur Fixierung. Setzen Sie ein medizinisches Tuch auf dem Teller. Mit vier Nadeln, fix eine Inhalationsmaske auf der Korkplatte zur intraoperativen Inhalationsnarkose. </li></ol></li><li> Vorbereitung des Portalvenenkanüle <ol><li> Anschluss eines peripheren Venenkatheters (G 20) mit einem Dreiwegehahn. Der Katheter sollte schräg abgeschnitten werden, mit einer Länge von rd. 1,5 cm. </li><li> De-Luft das System mit einem 10-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. Es ist sehr wichtig, sorgfältig zu entlüften, da Gasembolie kann sich negativ auf die Durchblutung Dezellularisierung. </li></ol></li><li> Vorbereitungder Arterienkanüle <ol><li> Verwenden Sie ein Schmetterlingskanüle und schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 5 mm. Setzen Sie einen 5 cm Schlauch (ID 0,58 mm, AD 0,96 mm) auf die 5 mm Nadel setzen und mit Sekundenkleber. Legen Sie eine 2 cm lange Rohr (ID 0,28 mm, AD 0,61 mm) in das größere Rohr montieren und mit Sekundenkleber. </li><li> Gleiten Sie einen anderen Schlauch über diese Konstruktion als Anschlag montieren und mit Sekundenkleber. De-Luft die Arterienkanüle mit einem 5-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. </li></ol></li><li> Anästhesie und Analgesie <ol><li> Induzieren Narkose der Ratte im Narkoseinduktionskammer um 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,5 L / min. </li><li> Um sicher zu Analgesie während des Betriebs zu gewährleisten, injizieren Metamizol (100 mg / kg Körpergewicht) und Niedrigdosis Ketamin / Medetomidin (10 mg / 0,1 mg pro kg Körpergewicht) intraperitoneal. </li><li> Liefern 1,5% Isofluran in 1 l / min Sauerstoff über der Inhalationsmaske für die spätere Wartung der chirurgischen Anästhesie. </li></ol></li><li> Präoperative Arrangements &lt;ol&gt; <li> Rasieren Sie den Bauch zügig mit einer elektrischen Schermaschine. Feuchten Sie die rasierte Einschnittstelle auf dem Bauch mit 70% Ethanol zur Desinfektion. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem vorbereiteten Platte, legen Sie den Kopf in die Inhalationsmaske und die Extremitäten mit medizinischem Klebeband und Stifte zu befestigen. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol und Fell mit einem Gazekompresse. </li></ol></li><li> Anästhesie-Bewertung <ol><li> Beurteilen Sie die Narkose Tiefe durch die Beobachtung der Atemfrequenz. Wenn die Betäubung scheint tief genug (40-60 Atemzüge / min), zu prüfen, ob Analgesie ist, indem Sie versuchen, um die Zehe Prise Reflex mit chirurgische Pinzette, um die Haut zwischen den Zehen beider Hinterbeine klemmen auslösen ausreichend. </li></ol></li><li> Bauch-Ansatz <ol><li> Machen Sie eine Medianschnitt in die Schwanzbauchdecke über der Blase. Von diesem Punkt an beiden seitlichen Rippenbögen in einer V-förmig geschnitten. Achten Sie darauf, in die Membran geschnitten. Ziehen Sie die Bauchdecke schneiden auf der Brust. </li&gt; <li> Befestigen Sie den Schwertfortsatz mit einem Overholt Klemme, ziehen Sie es nach kranial und fixieren Sie sie mit einem Gummiband. Verwenden nassen Wattestäbchen, um den Darm zu evakuieren. Wickeln Sie den Darm in einem feuchten Mullbinde. Darüber hinaus decken alle Bauchränder mit nassen Verband anlegen. </li></ol></li><li> Liver Vorbereitung <ol><li> Präparieren Sie die Ligamentum falciforme. Verwenden Sie einen feuchten Mullbinde auf die mediale und linken Leberlappen kranial unter der Kuppel der Membran zu halten. Setzen Sie das Ligamentum hepatoduodenale und die obere omental Leberlappen. </li><li> Verwenden Sie zwei microforceps und Frühjahr Schere sorgfältig sezieren das Band an der oberen omental Lappen angebracht, bis der Lappen ist mobil. Bewegen Sie den Lappen mit feuchten Wattestäbchen unter der Gazekompresse, halten die medialen und linken Lappen vorhanden. </li><li> Nach Mobilisation der oberen omental Leberlappen, bewegen Sie den Bauch auf der linken Seite. Befestigen Sie den Magen mit einer Klemme und sezieren die kleinere Netz mit microforceps und den Feder Schere. </li><li> Mobilisierung der unteren Omental Leberlappen, bis es ist mobil und anschließend die Lappen in seinem Hohlraum zu bewegen zurück. Benutzen Sie einen Haken, um den Backhaus Zwölffingerdarm zu behalten. Bewegen Sie den Zwölffingerdarm nach links zu dehnen und setzen den Ligamentum hepatoduodenale. Umschreiben den Gallengang in der gestreckten Ligamentum hepatoduodenale. </li><li> Präparieren Sie die Gallengang aus dem Fettgewebe und Pankreasgewebe. Schneiden Sie den Gallengang 1,5 cm aus dem Gallengang Bifurkation. Präparieren Sie die Pfortader aus dem umgebenden Fettgewebe. Setzen Sie das gastro-Vene. </li><li> Ligieren der gastroduodenalen Vene zweimal mit Seide 6-0 und teilen Sie die Vene zwischen 2 Ligaturen. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm und die gemeinsame Leberarterie aus dem umgebenden Gewebe, bis alle arteriellen rami enthüllt werden. </li><li> Befreiung der gastroduodenalen Arterie aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastroduodenalis zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die gastroduodenalen Arterie zwischen 2 Ligaturen. </li><li> Befreien Sie die Milzarterievon dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die Milzarterie zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Milzarterie zwischen den 2 Ligaturen. </li><li> Befreien Sie die A. gastrica sinistra aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastrica sinistra zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Arterie zwischen 2 Ligaturen. </li><li> Umgrenzen die Vena cava inferior zwischen der rechten Niere und der rechten seitlichen Leberlappen. Präparieren Sie die Vene aus dem Retroperitoneum. Expose der Aorta durch Befolgen des Truncus coeliacus. </li><li> Präparieren Sie die retroperitonealen Fettgewebe. Injizieren 1000 IE Heparin in 1 ml Kochsalzlösung in die untere Hohlvene. Ziehen Sie die Kanüle, und schließen Sie den Schnitt mit einem Wattebausch. Warten Sie 1-2 Minuten für die systemische Wirkung von Heparin. </li><li> Umschreiben die Aorta mit einer Pinzette. Präparieren Sie die Aorta und exsanguinate die Ratte. Weiterhin sezieren die untere Hohlvene sich distal von der Niere. </li></ol></li><li> Portal Venen-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.2 zubereitet) <ol><li> Machen Sie eine Fisch-Mund-Schnitt in der distalen Pfortader. Öffnen Sie die Schnittführung mit einer Pinzette und kanülieren die Pfortader. Spülen Sie die Leber mit 20 ml Ringer-Lösung, bis die Leber entfärbt und befestigen Sie die Kanüle mit Ligaturen (6-0 Seide). </li></ol></li><li> Arterien-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.3 zubereitet) <ol><li> Präparieren Sie die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus. Befreien Sie die Aorta Segment aus dem Retroperitoneum. Schneiden Sie die Aorta Segment in Längsrichtung, um einen Aorten-Patch zu erzeugen. Legen Sie die selbst gebauten Kanüle in einen statischen Halter. </li><li> Verwenden Sie 2 Pinzette, um die Aorta-Patch über der Kanüle gleiten. Ligieren die Leberarterie mit Seide 6-0 über die Kanüle und befestigen Sie den Patch auf den Anschlag. </li></ol></li><li> Liver Explantation <ol><li> Öffnen Sie die Blende, einen Zirkelschnitt und sezieren die Leber von den umgebenden Strukturen. </li></ol></li><li> Lagerung <ol><li> Store der Leber in einem sterilen 500 ml-Tank mit 350 ml Ringer-Lösung bis zur Verwendung gefüllt. </li></ol></li></ol> 2. Waschmittellösungen <ol><li> 10% Triton X-100-Stammlösung <ol><li> Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen Sie 100 ml Triton X-100 (99,9%). Verwenden Sie einen Rührer, die Triton X-100 zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist. </li></ol></li><li> 1% Triton X-100 <ol><li> 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000-ml-Flasche. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% Triton X-100-Lösung durch ein Sterilfilter. </li></ol></li><li> 10% SDS-Stammlösung <ol><li> Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen 66,99 g SDS (99,9%, Dichte 0,67). Verwenden Sie ein Rührwerk, das SDS zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist. </li></ol></li><li> 1% SDS <ol><li> 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000 ml bottle. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% SDS-Lösung durch ein Sterilfilter. </li></ol></li></ol> 3. Dezellularisierung <ol><li> Aufbau von Perfusionsvorrichtung <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Abb. 1: Schematische Darstellung der Perfusion Gerät zur Tiefen Arterielle und venöse Portal Perfusion von Four Rattenlebern unter oszillierenden Druckbedingungen (. Von Struecker et al modifiziert 14) <ol><li> Verknüpfen Sie die Drain mit einem Dreiwegehahn und einem Heidelberger Verlängerung, um den Füllstand zu regulieren und füllen den Reaktor mit 500 ml 0,9% NaCl. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Abb. 2: Schema der Perfusion Set-Up-Link-Perfusionskammer (1.400 cm 3) (1) zum distalen Ende (4) der Luftfalle (5) über die Pfortader Zugriff (2) oder über die arterielle acProzess (3). Die Blasenfalle (5) ist mit einem Verschließen (4) am distalen Ende und einer Entlüftungsöffnung (6) ausgestattet sein. Schließen Sie die Blasenfalle (5) zu einer Heidelberger Verlängerung (7). Verknüpfen Sie die Heidelberger Verlängerung der Pumpstrecke (8). Darüber hinaus schließen Sie das Pumpensegment (8) zu einem anderen Heidelberger Verlängerung (9). Legen Sie die letzten Heidelberger Verlängerung (9) in die Flasche Spülmittel-Lösung (10). Verbinden das Beatmungsgerät (11) an der Perfusionskammer (oder an den Druckverteiler in dem Fall von mehreren Infusionen). In den Reaktor Flüssigkeiten ablaufen, schließen Sie den Abfluss in die Abfallflasche (12). <ol><li> Setzen Sie die Pumpensegment in die Pumpe. Starten Sie die Pumpe, um den Zyklus mit PBS füllen, schließen Sie das distale Ende der Blasenfalle und öffnen Sie das Entlüftungs. Wenn der Boden der Blase fest mit PBS (2-3 cm) bedeckt ist, schließen Sie das Entlüftungs und öffnen Sie das distale Ende der Blasenfalle. </li><li> Liver Installations <ol><li> Verknüpfen Sie den Dreiwegehahn der Pfortader Kanüle dem Stand der Reaktorzugang. Cerbinden die Arterienkanüle mit dem arteriellen Zugang. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Systeme. </li></ol></li><li> Anwendung des oszillierenden Druckbedingungen <ol><li> Atemschutz mit einer Frequenz von 15 Schlägen pro Minute und einer Amplitude von 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Schließen Sie das Beatmungsgerät an die Druckverteilungskammer und schließen Sie die Kammer in den Reaktor. Starten Sie Druckanwendung. </li></ol></li><li> Dezellularisierung Protocol <ol><li> Zuführen Perfusion Stufen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. Starten Sie die Dezellularisierung mit Perfusion der Leber mit 1% Triton X-100 für 90 min. Erlauben Abfall Ausfluß über den Abfluss der Perfusionsvorrichtung bis der Flüssigkeitsstand im Inneren der Perfusionskammer konstant und über der perfundierten Leber halten. Nach 90 Minuten, ändern Sie das Reinigungsmittel auf 1% SDS. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Abbildung 3: Perfusion Protokoll für alle Versuchsgruppen.

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Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Obwohl die hier beschriebene Methode zur Rattenleber Ernte und Dezellularisierung wird leicht reproduzierbar, gibt es bestimmte kritische Schritte zu berücksichtigen: Während der Herstellung von Leber Ernte, ist es wichtig, zu schweren Blutungen zu vermeiden, da es die Blutgerinnung aktiviert und kann zu der Bildung von Blutgerinnseln in der Leber führen. Unserer Meinung nach ist es vorteilhaft, um die Bauchaorta direkt einzuschneiden vor Kanülierung der Pfortader, um den Blutzufluss über die Leberarterie während der Perfusion über die Pfortader zu vermeiden. Sobald die Leber einer Kanüle versehen und klar durchströmt, ist die Bildung von Blutgerinnseln kein Thema mehr. Nach einer Leber Ernte und Transport zum Perfusionsvorrichtung ist die Verbindung von Lebern zur Perfusionsvorrichtung ein besonders kritischer Schritt, da der Eintrag von Gasblasen in das Perfusionssystem Kreis muß vermieden werden, um Gasembolie zu verhindern. Es ist sinnvoll, um das Dreiwegeventil prefill, die ichs in die Leber Kanüle verbunden ist, mit PBS unter Verwendung einer Spritze und eine dünne Kanüle direkt vor dem Anschluss des Ventils an das Perfusionssystem. Nach Durchblutung festgestellt, ob alle Schlauchverbinder, Drei-Wege-Ventile und Rohre sind perfekt verbunden sollte neu überprüft werden. Wenn Lebern sind für längere Laufzeiten durchbluteten (z. B. O / N), auch ein kleiner Fehler in Verbindung, um Luft in den Siphon-Perfusion Systems führen, was zu tödlichen Perfusion Ergebnissen führen. Die vorgelegten Daten sind durch die Tatsache, dass der optimale Druck und die Frequenz des oszillierenden Druckänderungen für die besten Ergebnisse Dezellularisierung unklar beschränkt. Ferner kann druckgesteuert Perfusion bessere und stabilere Ergebnissen führen als stromgeregelte Perfusion tut. Druckgesteuerten Perfusion ermöglicht die Anwendung einer Perfusion Protokoll zu Lebern von unterschiedlicher Größe und Gewicht, mit dem gleichen Ergebnis, da die Strömung automatisch be angepasst. Die Leberarterie und Pfortader sind in Bezug auf Größe und physiologischen Flussraten signifikant unterschiedlich. Somit wird eine konstante Perfusionsgeschwindigkeit (5 ml / min) mit Sicherheit in verschiedenen Perfusionsdrücken innerhalb der beiden vaskulären Systemen führen. Ebenso wird ein konstanter Perfusionsdruck in verschiedenen Perfusionsraten führen. Eine Methode, um die Wirksamkeit Dezellularisierung über die beiden Durchblutung Routen vergleichen wäre, um die Perfusion bei physiologischem Perfusionsdrücke oder Perfusionsraten über beide Strecken durchzuführen. Allerdings sind die Ergebnisse vergleichbar in der aktuellen Studie zu machen, haben wir uns für eine konstante Perfusionsrate für beide Routen. Leider mit unserem Gerät waren wir nicht in der Lage, den Perfusionsdruck in perfundierten Leber zu messen. Perfusionsmodell Vorrichtungen der nächsten Generation wird kleiner, um die Menge an Perfusionsmedium notwendig minimieren. Darüber hinaus werden Pumpvorrichtungen ermöglichen druckgesteuerten Perfusion. The vorgestellte Technik wird sehr nützlich für die reproduzierbare, homogene Rattenleber Dezellularisierung. Ob die vorgestellte Technik für Rezellularisierung und Organreifung in vitro geeignet ist muss weiter behandelt werden. Ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Zellen neu besiedelt werden Gegenstand weiterer Experimente sein. Die vorgestellte Technik ist anspruchsvoller als andere Ratten Leberperfusion Geräten und zeigt mehrere entscheidende Vorteile: 1) Die homogene Dezellularisierung reproduzierbar ist, mit guten Ergebnissen bei oszillierenden Druckbedingungen angewendet werden. 2) Die Perfusion Gerät ist versiegelt und können sterile Dezellularisierung, die eine Voraussetzung für die Matrixwiederbevölkerung und langfristigen Durchblutung ist. 3) Das vorgestellte Protokoll ist kürzer als andere veröffentlichten Protokollen ist aber immer noch sehr effektiv. 4) Selektive Durchblutung der Pfortader und der Leberarterie macht selektiven Zellwiederbevölkerung über verschiedene Systeme möglich,was kann ein wichtiges Instrument sein. Die Perfusion Gerät wird in weiteren Dezellularisierung Experimente angewendet werden, um zu verfeinern und zu optimieren Rattenleber Dezellularisierung. Die Wirkung der druckgesteuerten Perfusion wird experimentell ermittelt und im Vergleich mit strömungsgesteuerten Perfusion werden. Der Zusatz von weiteren Elementen (z. B. ein &quot;Dialyseeinheit&quot;, einem Wärmetauscher, ein Oxygenator) erscheint für Bestandsaufstockung, Kultur und Reifung Experimente möglich und zumutbar wäre, die vorgestellt Gerät weiter zu entwickeln.

Dezellularisierung und Rezellularisierung kann die Erzeugung von funktionellen, transplantierbaren Organen in vitro 1 zu ermöglichen. Durch Entfernung von Zellen und antigenes Material (z. B. DNA, Alpha-Gal Epitope) von einem Organ, das nicht oder weniger immunogen extrazellulären Matrix (ECM), erhalten werden. Diese Matrix konserviert die dreidimensionale Mikroanatomie eines Organs und kann als ideal Biomatrix zur Repopulation mit Zellen einer anderen, möglicherweise xenogenen Ursprungs 2 dienen. Somit könnte eine dezellularisierte Rattenleber Matrix mit menschlichen Leberzellen wiederbesiedelt wird. Dieser humanisierte Mikro Leber könnte als Ex-vivo-Modell für die Erforschung von Krankheiten (z. B. angeborene Stoffwechselkrankheiten, Viruserkrankungen oder malignen Erkrankungen) oder für präklinische Arzneimittelprüfung 3 dienen. Mehrere verschiedene Protokolle für die Rattenleberdurchblutung Dezellularisierung wurden bereits veröffentlicht 13.04. In allen Protokollen decellularsierung wurde durch Perfusion von Alkali ionische oder nichtionische Detergentien über kanülierten Pfortader erreicht. Um das Beste aus unserem Wissen, wir waren die erste Gruppe, Rattenleber Dezellularisierung über die Pfortader und / oder dem Rattenleberarterie 14 zu melden durch selektive Perfusion. Aktivieren der selektiven Perfusion der verschiedenen Gefäßsysteme in der Leber besser Dezellularisierung Ergebnisse ermöglichen und darüber hinaus eine wichtige Rolle in der zellulären Wiederbesiedelung zu spielen. In der Studie detailliert hier wurden Lebern in einem maßgeschneiderten proprietären Perfusionsvorrichtung perfundiert, wodurch die Perfusion unter oszillierenden Druckbedingungen. Diese Druckbedingungen imitieren die physiologische Atemabhängigen Perfusion der Leber: in situ hängt der Leber unter dem Copula der Membran, deren Bewegung während der Atmung hat einen direkten Einfluss auf die Leberperfusion. Inspiration führt insbesondere zu einer Verringerung der Membran und Zusammendrücken der Leber, zu optimierenLeber-venösen Abfluss, führt in der Erwägung, Ablauf, um Höhe der Leber und der Absenkung der intraabdominellen Druck portal-venösen Zufluss 15 zu optimieren. Unser Ziel war es festzustellen, ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Homogenität der Rattenleber Perfusion Dezellularisierung durch die Nachahmung von intraabdominellen Bedingungen ex vivo haben. Die Homogenität der Dezellularisierung Prozess kann ein unterschätzter Faktor bei Perfusion Dezellularisierung sein. Alle bekannten Mittel verwendet für Leber Dezellularisierung Ursache Änderungen an der ECM. Zellen in schlecht durchbluteten Gebieten bleiben im ECM, während andere Bereiche bereits vollständig dezellularisiert. Um die restlichen Zellen zu lösen, muss der Perfusion Dauer oder Druck erhöht werden, was zu mehr Veränderungen an den gut durchbluteten Bereichen. Daher sollten Reinigungsmittel für Dezellularisierung homogen innerhalb des Organs verbreitet werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Die Homogenität und damit die Wirksamkeit der verschiedenen Dezellularisierung Protokolle wurden durch makroskopische Beobachtung histologischen Analyse und Analyse der verbleibenden DNA-Gehalt innerhalb dezellularisierte Leber Matrizen ausgewertet. Darüber hinaus wurde Korrosionsgießtechnik geführt, um die intakte Mikroanatomie der Leber nach Dezellularisierung visualisieren. Makros Während Dezellularisierung, Leber geworden Lucent, was die Entfernung von Zellgehalt. Lebern über die Pfortader perfundiert zeigte inhomogenen Aufklärung (und somit Dezellularisierung) mit makroskopisch sichtbaren verbleibenden Zellen während und nach der Dezellularisierung (weiße Pfeile). Livers über die Leberarterie durchbluteten zeigte eine homogenere Dezellularisierung Platz und keine sichtbaren übrigen Zellen. Wenn Lebern wurden bei der Anwendung der oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden keine restlichen Zellen sichtbar ist, unabhängig von der Perfusion Route. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> Abbildung 4: Makroskopische Ergebnisse von Rattenleber Dezellularisierung ohne oszillierenden Druckbedingungen. Links: Rattenleber über die Leberarterie dezellularisiert. Die Leber wird Lucent, ohne makroskopisch sichtbare übrigen Zellen. Rechts: Leber über die Pfortader perfundiert. Die Leber erscheint inhomogen dezellularisiert mit makroskopisch sichtbaren Zellen <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig5.jpg" /> Abbildung 5: Makroskopische Ergebnisse der Rattenleber Dezellularisierung unter oszillierenden Druckbedingungen. Links: Rattenleber über die Leberarterie dezellularisiert. Rechts: Leber über die Pfortader perfundiert. Beide Lebern erscheinen Lucent, ohne sichtbare übrigen Zellen. Histologische Bewertung Die histologische Auswertung der dezellularisiert Leber Matrizen Unterstützunged die makroskopischen Befunde. Livers über die Leberarterie durchbluteten zeigte keine restlichen Zellen, unabhängig davon, ob sie unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. Lebern über die Pfortader perfundiert zeigte Zonen der übrigen Zellen, auch wenn sie mit der Anwendung von oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden. Allerdings ist die Anwendung von oszillierenden Druckbedingungen reduziert die Restzellmasse in der Leber über die Pfortader perfundiert. Das ECM der Lebern wurde konserviert, ohne sichtbare Unterschiede in allen angewendet Protokolle. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig6.jpg" /> Abbildung 6: H / E-Färbung der Dezellularisierte Liver Matrices. AP: Dezellularisierte Lebermatrix über die Leberarterie ohne oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. A + P: dezellularisierte Leber Matrix über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. PA-P: dezellularisierte Leber matrix über die Pfortader ohne oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. PA + P: Dezellularisierte Lebermatrix über die Pfortader unter oszillierenden Druckbedingungen durchblutet. Arrows: Verbleibende Zellhaufen. DNA-Gehalt Der DNA-Gehalt pro Trockengewicht der Lebermatrix sank in allen Versuchsgruppen verglichen mit der in nativen Leber, obwohl Unterschiede waren statistisch signifikant nur in den Gruppen unter oszillierenden Druckbedingungen (PV + P; A + P) perfundiert. Die geringste Menge an DNA pro Trockengewicht wurde in der Leber über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchströmt gefunden. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig7.jpg" /> Abbildung 7: DNA-Gehalt pro Trockengewicht der Leber Matrix (von Struecker et al 14 modifiziert.). Livers über die Leberarterie Show dezellularisiert weniger verbleibende DNA als jene perfused über die Pfortader zu tun. Livers unter oszillierenden Druckbedingungen durchbluteten weniger anzeigen restlichen DNA als dezellularisiert ohne diesen Bedingungen zu tun. So, Leber über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen durchbluteten zeigen die mindestens verbleibende DNA-Gehalt. Korrosions Casting Korrosions Gießen dezellularisierte Leber Matrizen bestätigt, dass die Mikroanatomie der Leber (einschließlich des Proteins Rahmen der Pfortader-System, das Arteriensystem und Gallensystems) während Dezellularisierung konserviert. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig8.jpg" /> Abbildung 8: Fotographie eines Korrosions Casting eines Dezellularisierte Rattenleber Matrix (von Struecker et al 14 modifiziert.). Trotz Entfernung aller Zellen, die Mikroanatomie des Organs, einschließlich der Pfortader (blau) und arterielle (rot) Systemen werden konserviert. REMAining Hauptzweige des Gallensystems sind gelb gegossen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /> Tabelle 1: Versuchsgruppen zur Bewertung der Auswirkungen von oszillierenden Druckbedingungen und die Perfusion Strecke auf Rattenleber Dezellularisierung.

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Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Serie: Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Biochemie

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Ingenieurwesen

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biologie

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Medizin

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...