Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Brent Harris para a prestação de revisão crítica do manuscrito. Estes estudos foram realizados no Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopatologia &amp; Tissue recurso compartilhado que é apoiado em parte pelo NIH / NCI subvenção P30-CA051008. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou o National Institutes of Health.

1. Construção do local <ol><li> Adicionar 50 mg de Albumina de Soro Bovino (BSA) a 1 ml de tecido corante de marcação num tubo de 15 ml ou 2 ml tubo de microcentrífuga e vortex durante 1 minuto ou até estar completamente dissolvido. Nota: Para este protocolo, utilize bioquímica Grade BSA. Enquanto outros graus e purezas não foram testados, espera-se que o grau ea pureza não teria um impacto significativo sobre o sucesso do local. </li><li> De calor 9 ml hidroxietil gel de agarose de processamento em um tubo de 15 ml em um micro-ondas a 30% de potência para incrementos de 10 seg até que o gel esteja completamente derretida. </li><li> Combine o gel processamento derretido e solução de corante-BSA em um único tubo de 15 ml e misture bem com uma pipeta. Vortex a solução. </li><li> Colocar o tubo cónico num frigorífico durante algumas horas ou até que o sólido. </li><li> Use um, magro, espátula de metal longo ou sonda para liberar suavemente a camada de gel colorido do tubo cônico. </li><li> Use uma lâmina de bisturi ou navalha para cut do gel ligar transversalmente em cinco milímetros de espessura. Retire as extremidades arredondadas e as trate como lixo (Figura 2A). </li><li> Coloque as seções de plug gel planas em cassetes de histologia e segure em etanol a 70% durante 1 hora. Alterar a solução de etanol a 70% a cada 2-4 horas durante pelo menos três mudanças ao longo de um período de 24 horas. </li><li> Processar manualmente as secções de gel através de uma série de etanol (1 hora cada: etanol a 70%, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações 3x), em seguida, solução clara na limpeza 3x durante 1 hora cada um (por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos ( xilenos substituto)) foram utilizados no presente protocolo, xilenos também são aceitáveis), e infiltrar-se com parafina fundida (3x durante 1 h cada), manualmente ou em processadora de tecido. Nota: antes da desidratação completa em etanol a 100%, o corante pode vazar a partir da camada de gel que pode afectar outros tecidos e os reagentes líquidos num processador automatizado de tecidos. Como tal, a reidratação manual é altamente recomendado, no entanto processamento automatizado é equaliado eficaz. </li><li> Várias seções gel processado Incorporar usando parafina padrão incorporação de metodologia (Figura 2B). Permitir blocos para esfriar e endurecer e, em seguida, voltar à temperatura ambiente. </li><li> Utilize uma agulha de punção dérmica tamanho desejado para remover núcleos local das secções embutidas em gel até que o bloco se esgota (Figura 2C). Um único bloco pode fornecer até 20 x 2 milímetros 2 núcleos. Armazenar os núcleos em local fresco. Use dérmica perfurador neste protocolo ver Figuras, um 1,5 mm (Figuras 1D e 2D) ou 2 mm (Figuras 1B, 1C e 2C). </li></ol> 2. Usando pontos para Blocos Orient Non-dispostas <ol><li> Criar um diagrama de orientação do tecido para indicar os locais e as identidades de todos os pedaços de tecido individuais a serem incorporados em conjunto desejados, e a localização do local. NOTA: O diagrama orientação tecido é um mapa ilustrado que inclui o physical locais de todos os pedaços de tecido rotulados com identificadores ea localização do local. Ele pode ser criado eletronicamente ou pode ser desenhado à mão. O diagrama deve ser criado usando qualquer método que melhor se adequa ao técnico e pesquisador de utilizar o produto final. O mapa servirá como guia para o pesquisador tão amostras podem ser facilmente identificados durante a análise microscópica. O mapa utilizado neste protocolo foi desenhada à mão. Descreve um bloco de tecido e vidro lâmina de microscópio com cada peça de tecido eo ponto desenhado e rotuladas na mesma posição que o bloco de tecido real e slide. </li><li> Processar os pedaços de tecido, normalmente, garantir que se mantêm devidamente identificados durante todas as etapas de processamento e extrapolação. Para este protocolo, processar os tecidos durante 1 hora cada em: 70% de etanol, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações x3), hidrocarbonetos alifáticos (xilenos) de substituição (alterações x3), e fundido a infiltração de tecido em parafina 60 ° C (mudanças x3). NOTA: Atecidos ll devem ser processados ​​de acordo com procedimentos de laboratório de histologia padrão. Isso pode ser variável devido a procedimento laboratorial individual, a dimensão eo tipo de tecido, mas isso não afetará a capacidade de usar o local como uma ferramenta de orientação. </li><li> Disponha pedaços de tecido sobre a estação de incorporação nos locais corretas atribuídas de acordo com o diagrama de orientação tecido. Use o diagrama orientação tecido como uma referência para orientar o técnico sobre como organizar as peças local e tecidos em cada bloco. NOTA: Neste protocolo o técnico incorporação de colocar a orientação do mapa desenhado à mão ao lado da estação de incorporação e organizados os pedaços de tecido na estação de incorporação em exatamente o mesmo arranjo como desenhado no diagrama. Isto assegura que todos os pedaços de tecido permanecem correctamente identificáveis ​​no produto final. Isto é absolutamente essencial para o sucesso do uso de blocos multi-tecido. </li><li> Certifique-se o núcleo local é mais alto do que todos os pedaços de tecido para ser incorporado no bloco. </li><li> Incorporar os pedaços de tecido e, em seguida, a mancha na final (transversal) nos locais apropriados de acordo com o diagrama de orientação tecido usando a metodologia de incorporação padrão. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até a parafina tem solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min). </li><li> Seção de parafina e mancha seções com o local utilizando metodologia padrão. <ol><li> Permitir que as secções a flutuar num banho de água a 40 ° C e aderida a uma lâmina de vidro carregadas positivamente (lâminas não carregadas não foram testados). Secam-se as lâminas em um forno de secagem a 60 ° C durante pelo menos 20 min. </li><li> Colocar as lâminas em um corante automático e transformados por meio dos seguintes reagentes: xilenos (xilenos 1-5 min, xilenos 2 e 3-2 minutos, cada), etanol a 100% (2 min), etanol a 95% (1 min), 80 % de etanol (30 seg), etanol a 70% (30 seg), em água corrente (2 min), Hematoxilina (1,5 min), água corrente (3 minutos), o álcool do ácido (1 min), água da torneira corrente (2 min ), blreagente sional (1 min), água corrente (2 min), etanol a 80% (30 seg), eosina (1 min), água corrente (10 seg), etanol a 80% (1 min), etanol a 100% (3 mudanças, 2 min cada), xilenos (3 mudanças, 30 s cada). </li><li> Cobrir as lâminas com lamelas de vidro, montado com meio de montagem. NOTA: Neste protocolo, o histotechnician seccionados os blocos de parafina em um micrótomo em 5 mm seções. Para este protocolo foi utilizado um corante automática, no entanto resultados iguais pode ser obtido através de coloração manual. </li></ol></li></ol> 3. natural em TMA (Manual TMA Kit) <ol><li> Criar um diagrama de orientação do tecido, como descrito em 2.1 e atribuir o local desejado (s) do local. </li><li> Encha o molde TMA com parafina derretida em uma estação de incorporação. À medida que o molde é de arrefecimento, incorporar o local (s) no fim das margens do molde TMA nos locais desejados indicados pelo diagrama de orientação tecido. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até o ha parafinas solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min). </li><li> Monte os núcleos TMA acordo com as instruções do fabricante e no que respeita à localização do ponto (s) nas margens de matriz (Figura 2D), e seguir os protocolos de seccionamento e coloração padrão. NOTA: Por favor consulte o passo 2.6 para ver os métodos de seccionamento e coloração utilizados neste protocolo. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Preparação bem sucedida e utilização dos pontos exige a adesão cuidado para algumas etapas técnicas. Fusão do agarose hidroxietil deve ser feito lentamente e em fogo baixo. Derretendo rapidamente no calor elevado pode resultar em alguma repartição do agarose por menos de ótimos resultados. Ao cortar as fichas de corantes de carga em partes para processamento, assegurar que a espessura de cada peça é superior a 4,5 mm e não superior a 7 mm. As extremidades arredondadas são removidas como desperdício uma vez que não são uniformemente de 5 mm de espessura. Pieces inferior a 5 mm resultará na criação de pontos mais curtos que o risco de ser esgotado pelo seccionamento antes do esgotamento do material de tecido adjacente. Para assegurar o local está presente através da totalidade do bloco, as peças precisam ser, pelo menos, 4,5-5 mm. Para assegurar a infiltração adequada de cera, no entanto, as peças não deve exceder 7 mm. Quando desidratar os pedaços de corante para cera de infiltração, o corante será liberado um pouco fora das peças no lower As concentrações de etanol. A lixiviação não afeta o produto final, os pontos ainda será intensamente tingido e claramente visíveis. A lixiviação pode impactar em outros tecidos, no entanto, assim que as secções de tecido não deve ser processada nos mesmos banhos como as peças de corante até que os pedaços tenham atingido 100% de etanol. Ao colocar os pontos nos blocos dispostos, garantir que todos os outros colocação tecido está completo antes de adicionar o local. Uma vez que o local é infiltrado com parafina, a cera derretida do bloco receptor pode começar a derreter o núcleo local se for permitido sentar-se por muito tempo. Organizar todos os pedaços de tecido em primeiro lugar, adicionar o núcleo local e imediatamente transferir o bloco a uma placa fria para evitar qualquer fusão do local. O local pode ser modificado para caber na maioria dos fluxos de trabalho de laboratório de histologia. A cor do corante pode ser alterado para contraste óptima em cada aplicação. Corante vermelho ou preto produz alto contraste claro em lâminas de IHC manchados, wnquanto a mancha vermelha não é tão atraente em um slide H &amp; E manchada de secções de rim dispostas. Para H &amp; E slides, manchas verdes ou amarelas tendem a proporcionar maior contraste. Além disso, sob o calor elevado durante os processos de recuperação antigênica induzida por calor imuno-histoquímica, a agarose hidroxietil derrete. BSA é adicionada ao corante durante a preparação do local para manter um ponto brilhantemente colorido no slide, mesmo depois de métodos de recuperação de calor intenso. Se as lâminas não irá ser exposto a calor elevado, a BSA pode ser omitida no caso de produção local mais rápido. Os aspectos mais críticos do uso do local está na criação e manutenção de um mapa de orientação clara e concisa ea adesão fiel ao mapa quando colocar o ponto. Quando usado corretamente, o local reduz a confusão sobre o arranjo de tecido e simplifica a comunicação entre técnicos e pesquisadores, como o técnico de incorporação pode simplesmente indicar a localização do ponto e da relação do tissues a ele em um mapa. Spot é claramente visível em todas as etapas de preparação das lâminas permitindo a seção altamente consistente de montagem em lâminas para análise a jusante mais fácil. Em contraste com marcadores fisiológicos, o local é claramente visível em cada seção e não modifica o tecido de forma alguma, impedir a introdução de artefatos ou obstrução da morfologia. Ao contrário do método de incorporação de tecidos de forma assimétrica, o local permite investigadores técnicos e a flexibilidade na disposição dos tecidos para optimizar a análise visual ao microscópio. Em TMA, a mancha pode ser colocado fora da matriz principal, eliminando a necessidade de espaços em branco, conjuntos assimétricos, ou para núcleos de baliza, permitindo que toda a matriz ser composta de secções de tecido valiosos. O local também pode ser usado para indicar a direcção anatómicos (por exemplo, distai ou proximal) de amostras de tecido. O local é uma solução simples e de baixo custo para a orientação fácil e consistente de amostras de tecido durante a construção e umnálise de blocos multi-tecidos e TMA.

A capacidade de incorporar amostras de tecido de várias pessoas em um único bloco de parafina permite fácil comparação lado a lado entre os tratamentos e indivíduos, elimina a variabilidade entre os slides, e reduz o custo ea carga de trabalho de corte e coloração espécimes. Estes blocos multi-tecidos são tipicamente produzidos quer como micromatrizes de tecidos (TMA) ou blocos de parafina contendo tecido de vários indivíduos num esquema não-matriz. Manutenção de identidade amostra é crítica para o sucesso de qualquer análise multi-tecido. Os investigadores têm vindo a utilizar TMAs desde o seu desenvolvimento para melhorar a eficiência da análise, reduzir a variação entre os slides, conservar os recursos de tecidos valiosos, e reduzir o tempo eo custo de experimentos 1. A orientação correcta de TMA pode ser conseguida utilizando uma variedade de métodos, incluindo os espaços em branco, linhas ou colunas entre núcleos dos tecidos, 2-4 disposição assimétrica dos grupos principais 3, 5 (por exemplo, control vs. tratamento), &quot;baliza&quot; núcleos 6, e núcleos de orientação designados situados fora da matriz TMA 3. Embora estes métodos funcionam bem para TMAs, mais consomem valioso espaço TMA núcleo e TMAs com lacunas e espaços como identificadores pode tornar-se confuso para enchimento de tecido estão esgotados ao longo do tempo. Além disso, estes métodos não são apropriados para uso em blocos multi-tecido sem um formato de matriz porque dependem de anomalias no padrão bem ordenada de núcleos de microarray uniformes como identificadores. A maioria dos blocos não vestiu multi-tecido deve acomodar tecidos não uniformes e, por definição, não exibir a grade de matriz estruturada que faz com que essas aberrações destacam-se como pontos de referência. Embora existam muitas vantagens em usar uma TMA, uma das maiores desvantagens é o tamanho pequeno dos núcleos o que nem sempre é representativa de tecido 1, em grande parte heterogénea. Blocos multi-tecido não-dispostas fornecer muitas das tele se beneficia de um TMA, mas contêm amostras de tecidos maiores, ou órgãos inteiros a partir de estudos com animais. Tissue microarrays utilizando núcleos individuais têm diferentes concordância com seções inteiras de tecidos com base na proteína de interesse e muitos exigem múltiplos núcleos para maior concordância 7-11. Devido à complexidade e heterogeneidade de alguns fenótipos de biomarcadores, TMAs usando até mesmo um grande número de núcleos (&gt; 10) podem ainda ser insuficiente e pode exigir que não sejam microarrays para a análise de oito métodos. Além disso, TMA construção é demorado, tecnicamente exigente, e exige que o custo inicial eo investimento em ou acesso a um arrayer tecido. Blocos multi-tecido não dispostas pode ser feita em qualquer laboratório de base com significativamente menos tempo e esforço e é uma alternativa válida para os estudos que exigem mais do que matrizes de tecido permitir ou como um meio para reduzir custos e simplificar a análise. Blocos não-vestida multi-tecido semelhante requerem um ou fiávelientation marcador para monitorar a identificação da amostra, no entanto, o desenvolvimento desses marcadores tem sido limitada. Muita da literatura que descreve a orientação se concentra na orientação do tecido fisiológico correcto para a incorporação de peças de tecidos individuais, tais como o tecido de tatuagem com 12 de tinta, pré-incorporação de tecidos em meio de ágar-gelatina antes de processamento 13, e marcação certos tecidos com entalhes 14 ou 15 Suturas . Embora funcionais, estes métodos não são ideais como marcadores em blocos multi-tecido, devido às suas limitações. A sutura será seccionada por meio rápido e talvez não sejam visíveis em cada seção. Usando técnicas de ágar-gelatina pode manter o tecido na orientação adequada durante o processamento e incorporação pré-incorporação, mas não fornece uma indicação visual para diferenciar entre múltiplas amostras no bloco de parafina e lâminas. Entalhes ou corante no tecido pode complicar a análise ou ocluir importantes detalhes morfológicos. Alternativamente, a identidade dos tecidosem um bloco não-vestida multi-tecido pode ser mantida através da incorporação de peças de tecido numa disposição assimétrica, mas isto requer três ou mais peças de tecido e pode não permitir a disposição óptima dos tecidos para análise. A Orientação Tag Specimen (spot) foi desenvolvido como um método fácil e barato para identificar claramente tecidos em blocos multi-tecidos e oferece muitas vantagens sobre os métodos de orientação existentes. O local é um pequeno, colorido, núcleo composto por Hydroxyethyl gel de agarose e processamento de corante marcação de tecidos, e infiltrado com parafina (Figura 2C). O núcleo local é incorporado na extremidade próxima de um único tecido num bloco de parafina de multi-tecido e aparece como um ponto brilhantemente colorido no bloco e em cada secção (Figura 1A - D), indicando claramente a orientação correcta do bloco e secções para a identificação de tecidos fácil.

<table><tbody><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TMD-5</td><td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td></tr><tr><td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td><td>Arraymold</td><td>20015A</td><td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td></tr></tbody></table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Blocos de parafina do tecido multi-proporcionar análise de alto rendimento com o aumento da eficiência, uniformidade experimental, e redução do tempo e custo. Tissue microarrays compõem a maioria dos blocos de parafina multi-tecido, mas cada vez mais, os pesquisadores estão usando blocos não vestiu contendo tecidos maiores a partir de vários indivíduos que podem fornecer muitas das vantagens de microarrays de tecido sem investimento substancial no planejamento e equipamentos. Um componente crítico de qualquer análise multi-tecido é o método de orientação utilizados para identificar todos os tecidos. Embora existam métodos para manter a orientação e a identificação de tecidos em blocos multi-tecido adequado, mais não são adequados para os blocos não formado, pode consumir espaço valioso dentro de uma matriz e / ou são difíceis de produzir em laboratório histologia padrão. A Orientação Tag Specimen (spot) é uma ferramenta de baixo simples, orientação para os custos que é claramente visível em todos os blocos de parafina e cortes de tecidos for identificação espécime confiável em layouts dispostos e não dispostos. O local proporciona vantagens sobre os métodos existentes de orientação para blocos não-vestida, uma vez que não exige qualquer modificação directa ao tecido e permite flexibilidade na disposição dos pedaços de tecido.

O local aparece como um círculo, ponto brilhantemente colorido no bloco de parafina (Figura 1A e 2D), em todas as secções de parafina, e mantém-se na lâmina de vidro por meio do procedimento de H &amp; E ou IHC coloração (Figuras 1B - 1D e 2D). Este óbvias auxiliares de sinalização visuais tanto o histotechnician e pesquisador na identificação de cada peça de tecido individuais e simplifica a comunicação como o histotechnician pode usar esta sugestão visual para indicar a disposição das peças de tecido para o investigador a recolha de dados a partir da corrediça no microscópio. O diagrama orientação tecido deve ser incluído com os slides fornecidos com o pesquisador e explicado em detalhes assim não haverá nenhuma confusão durante a análise microscópica. Figura 2A mostra os resultados da secção dos solidificados, colorido plugues gel de agarose. Figura 2B mostra o resultado de incorporação o tampão de gel de agarose segmentados num bloco de parafina. A Figura 2C mostra os resultados da utilização de um punção dérmica para produzir os núcleos local. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: Ponto núcleos são facilmente criados e facilmente visível em blocos de tecido e slides (A) pontos são claramente visíveis no bloco incorporado.. (B) manchas permitir a fácil identificação e orientação de tecido para blocos multi-tecido contendo tecidos que aparecem similares de diferentes grupos de indivíduos / tratamento. (C) manchas permitir que cada núcleo de um Microarray do tecido a ser utilizado para amostras de tecidos valiosos. (D) Microscópio de vista local adjacente a um núcleo TMA. As setas indicam o local. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52868/52868fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Preparação de núcleos local (A) solidificados Hidroxietil plugs de agarose são liberados a partir de tubos de Eppendorf e cortado transversalmente em fatias de 5 mm. (B) várias fatias são incorporados num único bloco de parafina e (C) um perfurador dérmica é usada para remover manchas de núcleos. (D) As vagas são embutidos nas margens de um Microarray do tecido. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52868/52868fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções.

Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções. 

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Medicina

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly with many downstream assays such as next generation sequencing. Automated tissue dissection is a new methodology that automates and improves tumor enrichment in these common, low tumor content tissues by decreasing the user-dependent imprecision of traditional macro-dissection and time, cost, and expertise limitations of laser capture microdissection by using digital image annotation overlay onto unstained slides. Here, digital hematoxylin and eosin (H&#38;E) annotations are used to target small tumor areas using a blade that is 250 &#181;m2 in diameter in unstained formalin fixed paraffin embedded (FFPE) or fresh frozen sections up to 20 &#181;m in thickness for automated tumor enrichment prior to nucleic acid extraction and whole exome sequencing (WES). Automated dissection can harvest annotated regions in low tumor content tissues from single or multiple sections for nucleic acid extraction. It also allows for capture of extensive pre- and post-harvest collection metrics while improving accuracy, reproducibility, and increasing throughput with utilization of fewer slides. The described protocol enables digital annotation with automated dissection on animal and/or human FFPE or fresh frozen tissues with low tumor content and could also be used for any region of interest enrichment to boost adequacy for downstream sequencing applications in clinical or research workflows.

Digital annotation with automated tissue dissection provides an innovative approach to enriching tumor in low tumor content cases and is adaptable to both paraffin and frozen tissue types. The described workflow improves accuracy, reproducibility and throughput and could be applied to both research and clinical settings.

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Pesquisa do câncer

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Construção Manual de uma Microarray de Tecido usando o Método de Fita e um Microarrayer Portátil

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Mapeando a paisagem imune do tumor: um protocolo de análise IHC multiplex aprofundado

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

Autor em destaque: Desbloqueando insights sobre o cenário de células imunológicas de tumores

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Decifrando o microambiente tumoral usando mIHC no carcinoma escamoso de pulmão

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

Autor em destaque: Melhorando a localização de fluorescência multicolorida em amostra de carcinoma de pulmão

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Resumo

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Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Construção Manual de uma Microarray de Tecido usando o Método de Fita e um Microarrayer Portátil

Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral

Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral

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Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana