Name: controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
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Este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia. Microfabricação foi realizada com o apoio da academia de McGill Nanotools Microfab na Universidade McGill e do Departamento de Eletrônica da Universidade de Carleton.

O sangue é coletado de indivíduos saudáveis ​​com a aprovação do comitê de ética da Universidade de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Os microcanais são fabricados com base nos métodos de fotolitografia padrão 18. <ol><li> Projetar a geometria de microcanais utilizando um design de software assistida por computador (CAD) e imprimir a configuração em uma foto-máscara de transparência. Estas máscaras são cruciais, uma vez que ditam o caminho da luz durante o processo de fabricação. Neste caso, as dimensões são de microcanais 120 um de espessura, 60 mm de profundidade e 7 mm de comprimento. </li><li> Em uma sala de limpeza, revestimento de spin um epóxi negativa baseada foto-resiste em uma pastilha de silício a 2.000 rpm durante 30 segundos para obter a profundidade de microcanais desejado (60 mm). </li><li> Expor a bolacha e o foto-máscara sob uma lâmpada de UV a 650 mJ / cm 2 para 70 segundos. Assegurar a expor apenas as áreas transparentes dofoto-máscara à luz UV. A exposição das áreas transparentes permite a polimerização das cadeias, resultando em um endurecimento de foto-resist. Mergulhe a peça de silício em um desenvolvedor para remover o excesso de foto-resiste. </li><li> Uma vez que o molde é fabricado, misturar um elastómero à base de silício e um agente de cura a uma razão de 10: 1 para criar uma solução de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Coloque a solução PDMS em uma câmara de vácuo para desgaseificar. Deite-o no molde e aquecê-la a 60 ° C durante 90 minutos para criar microcanais. Em seguida, ligar os canais individuais para uma lâmina de vidro usando bonding plasma de oxigênio durante 90 segundos. Nota: o processo de PDMS desgaseifica é realizada a fim de eliminar as bolhas de ar geradas pelo processo de mistura. </li><li> Certifique-se de que as dimensões de microcanais para permitir testes bem-sucedidos. Neste protocolo, os microcanais têm uma secção transversal rectangular de 120 x 60 mm. Em comparação, um RBC média tem um diâmetro de 8 um e uma espessura de 2 um. Oguinte, a largura de microcanais é suficiente para observar a agregação adequada e determinar com precisão os perfis de velocidade. </li></ol> 2. Preparação de Sangue <ol><li> Recolha de sangue de doadores voluntários saudáveis, após a aprovação de um comitê de ética. Tratar o sangue com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) presente nos tubos de colheita (7,2 mg de EDTA em 4 ml de sangue). NOTA: O EDTA é utilizado para evitar a coagulação do sangue. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue três vezes durante 10 minutos a 1400 xg (3000 rpm) de modo a separar os constituintes do sangue. Como resultado da centrifugação, observar três camadas distintas. NOTA: As três camadas são a camada de RBC (localizado na parte inferior do tubo), o creme leucocitário (consistindo de glóbulos brancos e de plaquetas localizados no topo da camada de glóbulos vermelhos) e a camada de plasma (localizado na parte superior de todas as outras constituintes). <ol><li> Depois da primeira centrifugação, recolher o plasma sanguíneo, utilizando uma pipeta de sangue. Evite qualquer contato com o creme leucocitário. </li><li> Recolha e descarte o creme leucocitário em um recipiente com água sanitária diluída em 10%. </li><li> Adicionar 3 ml de PBS, pH 7,4 a cada um dos tubos com a camada de glóbulos vermelhos restantes e assegurar um equilíbrio adequado do centrifugador. Misturar suavemente os tubos e centrifugar uma vez a 1400 x g (3000 rpm) durante 10 min. NOTA: Certifique-se de que a solução PBS não contém qualquer magnésio ou de cálcio, uma vez que poderia alterar a adesão celular. </li><li> Descarte o PBS nos tubos após a segunda centrifugação e remover o creme leucocitário restante se presente. Repita os passos 2.2.3 e 2.2.4 para a terceira centrifugação para produzir hemácias limpas. </li></ol></li><li> Misturar a quantidade requerida (0,05, 0,1 e 0,15 mL) dos GVs limpas com plasma (0,95, 0,9 e 0,85 mL) num tubo de 1 ml, a fim de obter suspensões com RBC-a correspondente (5%, 10% e 15% ) hematócrito. Verifique hematócritos com uma microcentrífuga. </li></ol> 3. Fluidos Preparação <ol><li> Adicionar 60 ul da solução de partículas de marcador fluorescente (1% sólido, d partícula = 0. 86 uM, λ abs = 542 nm e λ emissão = 612 nm) para os tubos de 1 ml RBC-suspensão. NOTA: As partículas de marcador fluorescente (internamente tingidos partículas de poliestireno) são usados ​​para medir a velocidade do fluxo no interior do microcanal. Estas partículas fluorescem quando expostos ao comprimento de onda correspondente do feixe de laser (λ = 542 nm). </li><li> Prepara-se uma solução de PBS de pH 7,4 e adicionar 60 uL da mesma solução de partículas de traçador fluorescente em 1 ml de solução de PBS. </li></ol> 4. Agregados Tamanho Medidas <ol><li> Para inserir os fluidos (suspensões e RBC-PBS), no microcanal, utilizar duas seringas de vidro de 25 uL e 100 uL. Isso vaiajudar a reduzir a conformidade do sistema. Ligue os microcanais para as seringas através de tubos e conectores enquadrem nas orifícios de entrada. Encha as seringas de vidro utilizando a diferença de pressão existente entre o recipiente de fluido e a seringa. Assegurar não há bolhas de ar no sistema. Como um método alternativo, utilizar um sistema de pressão controlado para conduzir os dois fluidos no microcanal. </li><li> Coloque o microcanal em um palco microscópio invertido conectado a uma câmera de alta velocidade e um sistema μPIV. Programa da bomba de seringa para as taxas de fluxo desejados (por exemplo, Q = 2 l / h para o sangue gerando um caudal de Q = 8 l / h para PBS). NOTA: Somente uma bomba de seringa é utilizada. Usando duas seringas de vidro diferentes, com dois diâmetros internos diferentes, é possível fazer variar o caudal a que entra em cada ramo do Y-microcanal. </li><li> Insira ambos os fluidos no duplo Y-microcanais cada lado, de uma filial de entrada diferente e em diferentes vazões, como mostrado na <strong&gt; Figura 1. A fim de testar a diferentes taxas de cisalhamento, mudar o caudal da bomba. Isto mantém a mesma proporção apropriada (4, neste caso) entre os dois ramos 19 (Figuras 2 e 3). Aguarde até que o fluxo para atingir o estado estacionário antes de adquirir as medições: inspecionar visualmente as imagens da câmara de alta velocidade para um fluxo suave. Observação: A razão é importante na obtenção de um perfil de velocidade linear no interior da camada de sangue. </li><li> Visualize as hemácias utilizando a câmera de alta velocidade. Ligue a câmara a um computador para controlar, registrar e guardar as imagens do fluxo de fluido. Uma vez que os dois fluxos de fluido atingir o estado estacionário, iniciar a gravação. <ol><li> Adquirir várias imagens para obter melhores resultados de processamento. Determinar um tempo de exposição da câmara óptima para uma imagem clara dos agregados. NOTA: O tempo de exposição da câmara para este caso foi de 0,5 ms. A escolha do intervalo de tempo entre cada trama baseia-se na taxa de quadros da câmara e a velocidade de fluxo em tele microcanais. O tempo entre cada quadro processado neste procedimento foi de 60 mseg. Por conseguinte, uma câmara capaz de gravar 18 quadros por segundo é suficiente. NOTA: Evite a sedimentação de sangue no tubo e seringa, que poderia levar a medições erradas. </li></ol></li><li> Utilizando técnicas de processamento de imagens (um programa em Matlab, neste caso) para melhorar a qualidade da imagem, detectar os agregados em cada uma das imagens com base em intensidades de pixel (ilustrada na Figura 4) como se segue: <ol><li> Melhorar as imagens de contraste utilizando o método do histograma equalizador para se obter uma melhor qualidade de imagem para cada quadro. </li><li> Converta as imagens em tons de cinza em imagens binárias. Para este efeito, estabelecer um valor limite, que varia de 0 a 1, que determina a conversão de cada pixel. Qualquer pixel na imagem abaixo do valor limiar será detectado como um pixel preto, enquanto os pixels com valores maiores do que o limiar será detectado como pixels brancos. </li><li> Encha ofuros (se presente e necessário) correspondentes para as lacunas dentro de um agregado para obter melhores resultados. </li><li> Detectar as células por determinação pixels brancos vizinhos na imagem binária, de modo que as células adjacentes são associados na forma de agregados. </li><li> Rotular os diferentes agregados detectados e converter a imagem binária em uma imagem de vermelho-verde-azul (RGB) para melhor visualização. Combinam-se as imagens de origem com cada uma das imagens processadas correspondentes para verificar a eficiência da técnica de processamento de imagem e assegurar que todas as células são tomadas em consideração, como mostrado na Figura 5. Execute passos 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 e 4.5.5 para todos os quadros capturados. </li><li> Calcula-se a área de cada agregado detectado no quadro com base no número de pixels detectados. Com base na lente de ampliação usado, calcula o factor de conversão, usando uma retícula de calibração, e os resultados para converter 2 uM. Calcular a média dos tamanhos agregadas detectadas em cadaquadro e, em seguida, calcular a média dos resultados para todos os quadros para se obter o tamanho médio do agregado para cada gravação de RBC-suspensões. </li><li> Calcula-se a área de uma RBC para determinar um número representativo estimado de RBCs, em cada agregado detectado. Usando estes resultados, o cálculo da distribuição da percentagem de glóbulos vermelhos, em cada agregado como uma função dos tamanhos de agregado (representadas pelo número estimado de células em cada agregado), como mostrado na Figura 6. NOTA: Para medir os agregados RBC, software ImageJ poderia ser utilizado (em vez de MATLAB) para executar as mesmas tarefas em cada quadro. </li></ol></li></ol> 5. velocidade do fluido e cisalhamento Taxa de Medidas Determinar a velocidade do fluido e, portanto, a taxa de corte usando um sistema μPIV. <ol><li> Uma vez que os dados são adquiridos utilizando a câmera de alta velocidade, mudar para a câmera pulsado duplo usado para o sistema μPIV. Use um software de imagem para imagem acaqui- do fluxo do processamento de imagem e para a determinação de campo de velocidade. </li><li> Tomar todas as precauções necessárias, dependendo da classe do laser, antes de ligar o laser. Em seguida, ligar o sistema, a câmara eo laser. </li><li> Calibrar a câmara com base na ampliação da lente utilizada. Para esta finalidade, utilizar uma microescala de 10 um a precisão sob o microscópio e definir o tamanho de um pixel na imagem. </li><li> Iniciar o laser e visualizar as partículas em ambos os fluidos. Encontre o plano médio dos microcanais, concentrando-se sobre as partículas mais rápidas no fluxo (isto é, as partículas mais rápidas deve ser o mais brilhante). </li><li> Definir a DT (intervalo de tempo entre dois quadros consecutivos) para assegurar o deslocamento correcto da partícula. As partículas mais rápidas deve mover-se cerca de 5 a 10 pixels entre ambas as imagens. </li><li> Comece a gravar o fluxo. Defina o software para adquirir 100 pares de imagens, 5 ms de intervalo. Realize os passos 5.4, 5.5 e 5.6 para todo o difrentes RBC-suspensões e para diferentes taxas de cisalhamento. NOTA: Mais detalhes da metodologia são apresentados no estudo de Pitts e Fenech 20. </li><li> Processe as gravações adquiridos utilizando o método de correlação cruzada com o software de imagem. NOTA: Este consiste em discretizar o par de imagens em pequenas janelas de tamanho pré-determinado (com base no fluxo de fluido e o intervalo de tempo escolhido pelo utilizador) chamado janelas de correlação e seguindo o deslocamento das partículas em cada janela. <ol><li> Em primeiro lugar, determinar se as imagens obtidas requerem pré-tratamento (incluindo a subtração de fundo, &quot;base-grampeamento&quot; 21 ou imagem sobreposição 22,23) para um melhor processamento de dados. </li><li> Em seguida, escolha o tamanho da janela de correlação e forma, bem como da percentagem de imagens sobrepostas. Um estudo detalhado foi realizada por Pitts et al. 24, para determinar os parâmetros óptimos e técnicas de pré-processamento de imagem para sanguefluir em diferentes configurações de canal. Exprimir os resultados em um campo de velocidade média calculada a partir dos pares de imagem e 100 o erro Root Mean Square (RMS) na velocidade. </li></ol></li><li> Extrair um perfil de velocidade à saída do canal, a partir dos dados tratados, como mostrado na Figura 7. Para uma melhor perfil, a média do campo de velocidades no espaço. NOTA: As barras que constituem o perfil de velocidade corresponde ao tamanho da janela de correlação escolhidos em relação à largura do canal. O erro RMS da velocidade também é mostrado na Figura 7, que representa o erro na estimativa de velocidade experimental. </li><li> Desligue o laser uma vez que todas as medidas e processamento são executados ,. Desligue todos os componentes do sistema: software, câmeras, fase em movimento, computadores e laser. </li><li> Para calcular a velocidade de corte, primeira detectar e calcular a espessura de sangue nos microcanais com base na câmara de gravação de alta velocidade. Para este efeito, em média todosos quadros no registo específico para obter uma imagem de vídeo de fundo. Delimitar a camada de sangue (como mostrado na Figura 8 para as RBC-suspensões fluidas em 10 ul / h, quando suspenso em 5%, 10% e 15% hematócrito). Obter o valor de velocidade para a espessura da camada de sangue correspondente e calcular a velocidade de corte através da divisão do valor da velocidade por a espessura da camada de sangue. </li></ol>

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Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando a presente metodologia, é possível analisar, qualitativamente e quantitativamente, o RBC agrega sob diferentes condições de fluxo e hematócritos. Para os testes de detecção de agregados e bem sucedida, é crucial para determinar a relação da velocidade adequada entre os dois fluidos com a entrada de microcanais. Esta relação é muito importante para se obter uma espessura de camada de sangue ideal onde o perfil de velocidade é quase-linear 19. Outro fator fundamental para o teste bem sucedido é uma boa qualidade de imagem. Na verdade, uma vez que o método é baseado no processamento de imagem, é muito importante ter um contraste entre o fundo da imagem (o fluido no interior do canal) e as partículas a serem detectados. Aqui, como se mostra nas Figuras 2 e 3, as partículas parecem ser mais escura do que o fundo, o que ajuda na detecção agregado. O parâmetro mais importante a considerar para a técnica de processamento de imagem é o tvalor hreshold. Portanto, com base no contraste obtido é crucial para escolher o valor do limiar óptimo onde irá ser tomados em consideração todos os agregados, como mostrado na Figura 5. A presente segmentação da imagem, utilizada para este estudo, é amplamente utilizado para a detecção de células e contagem 25- 27. Se a qualidade da imagem não é tão desejado e um valor de limiar global não é adequado, pode-se usar um algoritmo diferente para determinar o limiar ideal, tais como o método de Otsu 28 ou um método de limiar adaptativo (discretização da imagem e a obtenção de um limiar local para cada janela discretizado). Outro factor a ter em conta é o fator de escala para uma conversão apropriada de pixels para um. Utilizando o factor de conversão adequada, pode determinar-se o diâmetro e a espessura de um RBC que irá servir para determinar a distribuição do tamanho dos agregados (com base na estimativa númer de glóbulos vermelhos em cada agregado). Dependendo da orientação dos agregados, calcular adequadamente a área de um RBC (vista frontal ou lateral). Tal como mencionado na secção 4 (passo 4.4.1), que é importante para determinar o tempo de exposição da câmara adequada e a taxa de frame para assegurar que as propriedades dinâmicas de os agregados são capturados entre cada trama consecutivo. Este valor é baseada na taxa de fluxo utilizado na aquisição de medições. Vários outros factores têm de ser tomadas em consideração aquando da aquisição de resultados que utilizam o sistema μPIV e são discutidos claramente no estudo de Pitts e Fenech 20. A metodologia foi testada com sucesso em vários RBC-suspensões que fluem no hematócrito diferente. No entanto, devido à limitação da técnica de processamento de imagem e a falta de contraste entre o fundo da imagem e dos agregados, é difícil detectar o RBC agregados para hematócritos mais elevados (a partir de 20% a 45%). Com efeito, como mencionadoanteriormente, a qualidade da imagem é crucial para esta metodologia. Usando este protocolo, o tamanho dos agregados de RBC pode ser medida num dispositivo de microfluidos controlada e, portanto, é possível obter informação sobre a agregação de glóbulos vermelhos dinamicamente na microcirculação e obter os tamanhos de agregados RBC para uma gama de velocidades de corte fisiológicas. É também possível complementar estudos numéricos e experimentais de reologia sanguínea e relacionar os tamanhos e o comportamento de agregação de estudos clínicos e patológicos.

An erratum was issue for <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

As células vermelhas do sangue (RBC) desempenham um papel crucial na determinação do comportamento reológico de sangue. Eles são quase singularmente responsável pelas propriedades particulares do sangue in vitro e in vivo. Sob condições fisiológicas, os glóbulos vermelhos ocupar 40% a 45% do volume de sangue. Na microcirculação, hemácias só ocupam até 20% do volume de sangue devido ao diâmetro dos vasos menores e o plasma efeito uma desnatação. Este fenómeno de redução de plasma na microcirculação é conhecido como o efeito Fåhraeus. Em baixas velocidades de corte, os glóbulos vermelhos são capazes de transpor em conjunto e formam um dimensional ou estruturas tridimensionais chamados &quot;rouleaux&quot; ou agregados, por conseguinte, contribuir para o comportamento não newtoniano do sangue. No entanto, o mecanismo de agregação de RBC não é completamente compreendido. Existem duas teorias para modelar a agregação de hemácias: a ponte da teoria células devido à ligação cruzada das macromoléculas 2 ea atrac vigorteoria ção provocada pela depleção das moléculas, devido ao gradiente osmótico 3. Tipicamente, para o sangue humano, formar agregados com taxas de corte muito baixos 4 variando de 1 a 10 s -1. Acima dessa faixa, hemácias tendem a desagregar e fluxo separadamente dentro do vaso. Compreender as condições da formação de agregados é de uma grande importância para o campo hemorreologia em termos de definir o comportamento reológico de sangue. Estes agregados são muitas vezes vistos a nível macrocirculação (&gt; 300 mm de diâmetro) 5. Nesta escala, o sangue é considerado como um fluido Newtoniano e de uma mistura homogénea. No entanto, estes agregados são raros no nível capilar (4-10 um de diâmetro) e são geralmente uma indicação de condições patológicas tais como a diabetes e a obesidade 6. Outras condições patológicas que poderiam mudar a agregação RBC incluem condições inflamatórias ou infecciosas,doenças cardiovasculares, como hipertensão ou aterosclerose, doenças genéticas e doenças crônicas 7. Portanto, a compreensão do mecanismo de agregação de glóbulos vermelhos e analisando estas entidades (por definição de uma relação entre o tamanho destes agregados e as condições de fluxo) pode conduzir à compreensão do comportamento microrheological de sangue e, portanto, relacioná-la com aplicações clínicas. Agregados RBC pode ser alterada por vários factores tais como o hematócrito (volume de glóbulos vermelhos no sangue), a taxa de cisalhamento, o diâmetro do vaso, a rigidez da membrana de RBC e a composição do meio de suspensão 8-10. Por conseguinte, são necessárias condições controladas, a fim de analisar de forma eficaz os agregados de RBC. Vários métodos são capazes de analisar a formação de agregados, fornecendo medições de agregação estáticos (índice de agregação) que oferece informações relevantes sobre o comportamento do sangue. Estes métodos incluem, inter alia, a taxa de sedimentação de eritrócitos11 método, o método de transmissão de luz de 12, o método de reflexão de luz 13 e o método de baixa viscosidade de cisalhamento 14. Poucos estudos tentaram estudar a agregação de RBC e determinar o grau de agregação em condições de fluxo controladas 15-17. No entanto, estes estudos indirectamente investigar RBC tamanhos de agregados por meio da determinação da relação entre o espaço ocupado em um sistema de corte medida com base em imagens microscópicas sanguíneos que fornecem informação sobre o grau de agregação, bem como a viscosidade local. Nós, portanto, apresentar um novo procedimento para quantificar directamente RBC agrega na microcirculação, de forma dinâmica, com taxas de corte controlado e constante. Rbc suspensões são arrastadas, num duplo Y-microcanal (tal como ilustrado na Figura 1), com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), criando assim um fluxo de cisalhamento na camada de sangue. Dentro desse sangue camada uma constante de karitétaxa R pode ser obtido. Os RBC-suspensões são testados em hematócrito diferentes (H) níveis (5%, 10% e 15%) e sob taxas de deformação diferentes (2-11 seg -1). A velocidade do sangue e velocidade de cisalhamento são determinados usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto que o fluxo é visualizada utilizando uma câmara de alta velocidade. Os resultados obtidos são, então, processados ​​com um código MATLAB com base nas intensidades de imagem, a fim de detectar as hemácias e determinar os tamanhos de agregados.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Plasma system&amp;nbsp;</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-50 series</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescent particles solution (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringes (50 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>High speed camera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>A camera capable of recording 18 frames per second could be used.</td></tr><tr><td>Double pulsed camera&amp;nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 and PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

O sangue, como biofluid não-newtoniano, representa o foco de numerosos estudos no campo hemorreologia. Constituintes do sangue incluem os glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas, que são suspensos em plasma sanguíneo. Devido à abundância das hemácias (40% a 45% do volume do sangue), o seu comportamento dita o comportamento reológico de sangue especialmente na microcirculação. Com taxas de corte muito baixos, hemácias são vistos de montar e entidades de formulário chamado agregados, o que faz com que o comportamento não-newtoniano de sangue. É importante compreender as condições da formação de agregados de compreender a reologia do sangue na microcirculação. O protocolo aqui descrito detalhes do procedimento experimental para determinar quantitativamente os agregados de RBC na microcirculação sob velocidade de cisalhamento constante, com base no processamento de imagem. Para este efeito, RBC-suspensões são testadas e analisadas em microcanais 120 x 60 mm de poli-dimetil-siloxano (PDMS). As suspensões são RBC-entchover usando um segundo fluido, a fim de obter um perfil de velocidade linear no interior da camada de sangue e, assim, obter uma grande gama de velocidades de cisalhamento constante. A velocidade de corte é determinada usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto agregados RBC são visualizados utilizando uma câmara de alta velocidade. Os vídeos capturados dos agregados RBC são analisados ​​usando técnicas de processamento de imagem, a fim de determinar os tamanhos de agregados com base nas intensidades de imagens.

Um exemplo do fluxo de dois fluidos no duplo Y-microcanal é mostrado na Figura 2 para os glóbulos vermelhos humanos suspensos em 5%, 10% e 15% de hematócrito e fluindo a 10 ul / h. A Figura 3 mostra a diferença no tamanho dos agregados quando o fluxo no canal é reduzido de 10 l / h a 5 uL / ​​hr de um hematócrito de 10%. Isto dá uma noção qualitativa dos tamanhos dos agregados ao variar o hematócrito e da taxa de cisalhamento. A Figura 5 segue o deslocamento de quatro agregados RBC humano, por três estruturas consecutivas, fornecendo uma medida qualitativa da taxa de quadros da câmara necessária e qualitativa da noção Agregados de distribuição no interior de cada quadro. Na Figura 5, os pequenos agregados (com glóbulos vermelhos 8 ou menos avaliado) são mostrados a azul, enquanto agregados (médias que variam de 9 a 30 estimativa RBCs) e agregados grandes (maiores do que 30 estimado RBCs) são mostrados em verde e vermelho, respectivamente. Figura 7, onde as curvas vermelhos, azuis e verdes representam os perfis de velocidade dos glóbulos vermelhos em suspensão em 5%, 10% e 15% de hematócrito respectivamente. Os erros de RMS da velocidade, também apresentados na Figura 7 para cada RBC-suspensão, são relativamente pequenos em comparação com os valores de velocidade, que indica a precisão das medições de velocidade e, portanto, as taxas de cisalhamento. As junções são indicados como &#39;E&#39; e mostrado como as linhas cheias na mesma figura. As taxas de corte correspondentes para as diferentes suspensões de RBC-(com base nos perfis de velocidade e a espessura da camada de sangue) são mostrados na Tabela 1. Os agregados de tamanho médios obtidos para cada uma das suspensões de RBC-, com base no método de processamento de imagem para detectar o área dos agregados RBC, são mostrados na Figura 9, como um functião da velocidade de cisalhamento correspondente. Um exemplo da distribuição da percentagem de glóbulos vermelhos, em cada agregado é mostrado na Figura 6. Os tamanhos de agregados são representados como uma estimativa do número de glóbulos vermelhos nos agregados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração Y-microcanais e dupla entrada de fluidos. O sangue entra a primeira filial no Q = 2 l / h, enquanto PBS entra na segunda filial em Q = 8 l / h. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig2.jpg" /> Figura 2.-RBC humano suspensão no hematócrito diferentes. A figura representa os quadros de RBC-humanos suspensões fluidas em Q = 10 mL / h a capturado (A) 5% (B)10% e (C) 15% do hematócrito. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig3.jpg" /> Figura 3.-RBC humano suspensão a diferentes caudais. A figura representa os quadros de os glóbulos vermelhos humanos suspensos em 10% de hematócrito H fluidas (A) Q = 10 l / h e (B) Q = 5 uL / hr capturado. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig3highres.jpg" target="_blank">favor aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig4.jpg" /> Figura 4. Fluxograma do programa de processamento de imagem utilizado para a detecção de agregados. Os passos apresentados descrevem a metodologia de base. A qualidade da imagem é melhorada para ser c<html> onverted para uma imagem binária. Os agregados são detectados e rotuladas com base nos seus respectivos tamanhos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig5.jpg" /> Figura 5. RGB coloração e movimento líquido das várias RBC humano agrega durante três quadros consecutivos. A figura mostra o movimento de líquido de quatro agregados detectados em três estruturas consecutivas em (A) t = 0 ms, (B) T = 60 ms e (C) t = 120 ms. Os grandes agregados (&gt; 30 estimada hemácias), agregados médios (30/09 hemácias estimados) e pequenos agregados (&lt;8 estimada hemácias) são mostrados em vermelho, verde e azul, respectivamente. Cada um dos agregados detectados são marcados com um círculo preto._blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig6.jpg" /> Figura 6. RBC distribuição de tamanho de agregado de 10% H RBC-suspensão para diferentes taxas de fluxo. Distribuição de tamanho de agregado de amostras de sangue em suspensão em 10% H, fluindo em Q = 10, 5 l / h. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig7.jpg" /> Figura 7. Comparação da velocidade de perfil para hematócrito diferentes. Os perfis de velocidade para os glóbulos vermelhos são mostrados no plasma em suspensão em 5% H (vermelho), 10% H (azul), 15% H (verde) e de simulação de 19 (linha sólida) para a 120 x 60 mm duplo Y-microcanais com Q = 10 l / h. A localização de interface é indicada por e para oexperimentos. Os erros RMS correspondentes dos diferentes perfis de velocidade são exibidos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig8.jpg" /> Figura 8. fundo da imagem para as diferentes RBC-suspensões e delimitação da espessura da camada de sangue. A figura mostra a delimitação da espessura da camada de sangue dos RBC-suspensões fluidas em 10 mL / hr suspensa às (A) 5%, (B ) e 10% (C) 15% H. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig9.jpg" /> Figure 9. agregados de tamanho médio como uma função das taxas de corte correspondentes. Os resultados são obtidos para os diferentes RBC-suspensões que fluem no Q = 10 l / h em 5% (A), 10% (B) e 15% H (C). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hematócrito </td><td> Caudal (l / h) </td><td> Velocidade de corte (seg-1) </td></tr><tr><td> 5% </td><td> 10 </td><td> 11.02 </td></tr><tr><td> 5% </td><td> 5 </td><td> 5.36 </td></tr><tr><td> 10% </td><td> 10 </td><td> 8.17 </td></tr><tr><td> 10% </td><td> 5 </td><td> 4.47 </td></tr><tr><td> 15% </td><td> 10 </td><td> 7,41 </td></tr><tr><td> 15% </td><td> 5 </td><td> 2.51 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os valores de taxa de cisalhamento para diferentes casos de fluxo de sangue. Os valores de taxa de corte são obtidos utilizando os dados de imagem e os resultados de processamento μPIV para diferentes RBC-suspensões com 5%, 10% e 15% de H, com um caudal de Q = 10 uL / hr e Q = 5 l / h.

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

O protocolo descrito detalhes um procedimento experimental para quantificar glóbulos vermelhos (RBC) agregados sob uma velocidade de corte constante e controlado, com base em técnicas de processamento de imagem. O objetivo deste protocolo é relacionar RBC tamanhos agregados à taxa de corte correspondente em um ambiente controlado microfluídico.

Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K visualizações.  University of Ottawa.  O protocolo descrito detalhes um procedimento experimental para quantificar glóbulos vermelhos (RBC) agregados sob uma velocidade de corte constante e controlado, com base em técnicas de processamento de imagem. O objetivo deste protocolo é relacionar RBC tamanhos agregados à taxa de corte correspondente em um ambiente controlado microfluídico. 

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Bioengenharia

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Biologia

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mecanobiologia de célula única usando aspiração de micropipeta de fluorescência

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to mechanical stress. This paper details an innovative adaptation of the fluorescence-coupled micropipette aspiration (fMPA) assay. The fMPA assay introduces the capability to administer precise mechanical forces while concurrently monitoring the live-cell mechanotransduction processes mediated by ion channels. The sophisticated setup incorporates a precision-engineered borosilicate glass micropipette connected to a finely regulated water reservoir and pneumatic aspiration system, facilitating controlled pressure application with increments as refined as &#177; 1 mmHg. A significant enhancement is the integration of epi-fluorescence imaging, allowing for the simultaneous observation and quantification of cell morphological changes and intracellular calcium fluxes during aspiration. The fMPA assay, through its synergistic combination of epi-fluorescence imaging with micropipette aspiration, sets a new standard for the study of cell mechanosensing within mechanically challenging environments. This multifaceted approach is adaptable to various experimental setups, providing critical insights into the single-cell mechanosensing mechanisms.

Autor em destaque: Avançando na mecanobiologia de células vivas por meio da microaspiração de fluorescência

The exploration of cellular behavior under mechanical stress is pivotal for advances in cellular mechanics and mechanobiology. We introduce the Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA) technique, a novel method combining controlled mechanical stimulation with comprehensive analysis of intracellular signaling in single cells. This technique investigates new in-depth studies of live-cell mechanobiology.

Ensaio de Aspiração por Micropipeta de Fluorescência para Investigar Mecanosensing de Hemácias

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...