Name: a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice at JoVE.com

The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

Todos os protocolos de mouse estavam de acordo com os institutos nacionais de saúde e orientações foram aprovadas pelo Comitê de animal Estudos da Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO). 1. Preparando a Placa e Recintos Testing <ol><li> Limpar a superfície do vidro. </li><li> Segurar a sonda termopar filamento do tipo T à superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório. </li><li> Colocar o animal independente sobre a placa de vidro em uma única linha ao longo do meio da placa. </li><li> Passe a sonda termopar através do cerco animal centro e ligar para o registrador de dados. Vire o registrador de dados enquanto a desativação do recurso de auto-desligamento, e anexar o registrador de dados para o computador com o cabo fornecido. <ol><li> Se a gravação da temperatura da placa durante o experimento, abra o software registrador de dados para começar a gravar temperaturas placa. </li><li> Se necessário, ajustar o software de recabo a temperatura da placa de uma vez a cada segundo. </li><li> Começar a gravar temperaturas usando o software fornecido com o registrador de dados térmico. </li></ol></li><li> Separe o recinto com pastilhas pretas para evitar a interação visual entre camundongos. </li><li> Posição espelhos por baixo do vidro de modo que a parte de baixo das caixas é visível a partir de uma posição sentada confortável. </li></ol> 2. O aquecimento / resfriamento da placa de vidro <ol><li> Preencha caixas de alumínio com água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco e posicioná-los de forma adequada sobre a placa de vidro (pacotes de folhas de alumínio preenchidos com gelo seco também pode ser usado para resfriar o vidro; Figura 1) 2. <ol><li> Para os testes, a 30 ° C, posicione as caixas de alumínio de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; longe dos recintos de animais (Figura 2B) 2. <ol><li> Definir um circulador de água aquecida em ambos os lados da placa de vidro. Definir o circulador para 45 - 60 ° C, e nósenviar um e-lo para preencher as caixas de alumínio com um fluxo constante de água quente (Figura 1C) 2. </li><li> Posicionar os circuladores de tal modo que a água quente a partir das caixas de alumínio escoa directamente de volta para dentro do reservatório da bomba de circulação em cada um dos lados (Figura 1C) 2. </li></ol></li><li> Para os testes à temperatura ambiente, deixar as caixas vazias (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes a 17 ° C, posicione as caixas de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; longe dos recintos de animais de cada lado e encher com gelo molhado (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes a 12 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 1,25 &#39;&#39; distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2. </li><li> Para os testes, a 5 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 0,25 &#39;&#39; distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) 2.<ol><li> Quando arrefecer o copo com gelo seco, verifique se não há ventilação suficiente para evitar o acúmulo de CO 2 no quarto. </li></ol></li></ol></li><li> Espera para o vidro para atingir a gama de temperatura desejada. </li><li> Adicionar os ratos para os compartimentos da placa. NOTA: Um gerador de ruído branco podem ser utilizados para diminuir as perturbações de ruído. </li><li> Aguarde até que os ratos para se aclimatar. NOTA: Em nosso serviço isso leva aproximadamente 2,5 horas, mas isso pode variar significativamente com base nas condições de manipulação e de alojamento dos animais. </li><li> Manter o vidro no intervalo de temperatura desejado, garantindo que as caixas são mantidas cheias de água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco. NOTA: Com o nosso aparelho as caixas precisam ser recarregados com gelo aproximadamente a cada 90 min. NOTA: Para a 17 ° C condição, é útil para esvaziar a maior parte da água das caixas de alumínio através dos furos de drenagem antes de enchê-lo com gelo. Isto irá estabilizar a temperatura melhor, e prevento estouro NOTA: A quantidade exacta do gelo seco irá variar sazonal, mas, em geral, mantendo as caixas de mais do que ¼ cheio ao longo de todo o comprimento da caixa, será manter a temperatura constante. </li></ol> 3. Teste o Mice em temperaturas fixas <ol><li> Do lado de fora da sala de comportamento, encher um balde de gelo sobre meio cheio de gelo seco. </li><li> Usando um martelo ou malho, esmagar o gelo seco em um pó fino. NOTA: O excesso de balde irá tornar mais difícil para esmagar completamente o gelo seco em pó. </li><li> Usando uma lâmina de navalha ou tesoura, corte a parte de cima de uma seringa de 3 ml. </li><li> Usando uma agulha de 21 G, picar 3 furos em lados opostos da seringa (total de 6 furos). NOTA: Estes furos vai diminuir a pressão gerada por sublimação, enquanto comprime o gelo seco. A seringa de corte pode ser reutilizada para vários experimentos. </li><li> Pegue na seringa, o pó de gelo seco, e um cronômetro de mão na sala de comportamento. </li><li> Encha a câmara de seringa meio cheio de pó de gelo seco. Segurar a extremidade cortada da seringa de encontro a um objecto chato, e firmemente comprimir o pó usando o êmbolo. Seja cuidadoso; o êmbolo plástico pode entortar ou quebrar com a pressão. Se isso acontecer, substitua o êmbolo de uma seringa nova. </li><li> Estender a ponta do comprimido sedimento gelo seco além da extremidade da seringa. </li><li> Ratos de teste que são completamente em repouso. <ol><li> A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, os ratinhos de teste, que têm todas as 4 patas sobre o vidro e não se deslocam, mas não totalmente 19 adormecido. </li><li> A 12 ° C e 5 ° C, os ratos de teste que são em 2 patas ou 4 patas e não em movimento ou de salto. </li></ol></li><li> Usando os espelhos para segmentação, gentil mas firmemente alisar o resplendor pellet contra a superfície de vidro debaixo da pata traseira do mouse (Figura 1A) 2. Comece a mão-timer. </li><li> Parar o temporizador e remover o sedimento quando o rato afasta-se do vidro arrefecida. NOTA: O movimento de retrocesso pode ser vertical ou horizontal. <ol><li> Se o mouse se move muito rapidamente a pata e, em seguida, retorna para a superfície de refrigeração, continuar a cronometragem e estimulando até que o rato faz um movimento permanente de distância. NOTA: O nosso laboratório usa um tempo máximo de 20 segundos de estímulo para os ratos, na maioria dos casos. </li></ol></li><li> Repita este procedimento até que o teste pelo menos três valores em cada pata de cada animal são coletados. Experimentações separadas testando as patas opostos no mesmo rato por, pelo menos, 7 min, e ensaios consecutivos separados em qualquer única pata por, pelo menos, 15 min. </li><li> Se for necessário, utilizam diferentes espessuras de vidro para gerar diferentes taxas de arrefecimento (Figura 3) 1. NOTA: A taxa de arrefecimento está inversamente correlacionada com a espessura do vidro. </li></ol> 4. Testando o Ratos Durante Fria Adaptação NOTA: Este é um protocolo alternativo que permite testar como o plat de vidroe esfria, ao invés de uma vez que a placa se estabilizou e os ratos estão totalmente adaptados ao ambiente frio. <ol><li> Siga as instruções listadas na Seção 1 para configurar o aparelho. </li><li> Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas de base na RT (Figura 7A) 2. </li><li> Pré-resfriar as caixas de alumínio com gelo seco. </li><li> Uma vez que as latências de retirada da linha de base foram medidos, posicione as caixas prï¿½arrefecida na placa aproximadamente 1,25 &#39;&#39; longe dos gabinetes de ambos os lados (Figura 7A, seta rotulado como &quot;gelo seco adicionado&quot;) 2. </li><li> Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas como a placa de vidro esfria, tomando medidas o mais rápido possível. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and genetic neuron ablation studies26. It can be modified to measure responses to a variety of rates of cooling using different thicknesses of glass, and the size of the cold stimulus applied can be altered using different sized syringes. 
The most critical step for performing this assay properly is cooling or warming the glass plate evenly during testing. Carefully arranging the aluminum boxes so that they are evenly spaced on either side of the animal enclosures will help generate more uniform temperatures. Marking the glass plate to standardize aluminum box placement between experiments will also improve the reproducibility of the assay, although these markings may have to be periodically recalibrated to account for seasonal variations in building temperature.
It can also be challenging to maintain a consistent glass plate temperature over the course of the experiments. Ensuring that the aluminum boxes are always evenly filled with dry ice/wet ice/warmed water will yield experiments with stable plate temperatures. Additionally, under the 17 &#176;C testing condition it may become more difficult to maintain the temperature as the wet ice melts. We recommend draining excess water from the melted ice out of the aluminum boxes before refilling with more wet ice. 
The main limitation is that the mouse paw must be in contact with the glass surface in order to ensure a consistent cold stimulus. This can be an issue in some neuropathic models, such as the chronic constriction injury, which can cause paw curling. Other challenges to obtaining reproducible results with this assay include that the mice must be fully at rest, which requires adequate acclimation periods. If the mice are too active for testing, it may help to allow longer acclimation periods. Finally, groups that are planning to utilize this assay must also ensure that there is sufficient ventilation in the room in order to prevent CO2 buildup when using large amounts of dry ice.

Medir a capacidade de resposta fria em roedores é importante para melhorar a compreensão dos potenciais mecanismos de sensibilidade frio em seres humanos, tanto em condições normais e patológicas. The Cold Plantar Assay (CPA), originalmente desenvolvido há vários anos um, é projetado para gerar, respostas inequívocas murino comportamentais reprodutíveis a um estímulo frio entregue na RT. Mais recentes melhorias deste ensaio permitiu a medida reprodutível de sensibilidade frio a uma vasta gama de temperaturas de 2. Ambas as versões também são projetados para ser relativamente alto rendimento, e barato de usar. Uma grande quantidade de progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos de sensibilidade frio usando outros métodos comportamentais. Um método é o teste de evaporação de acetona, enxugando ou que envolve a pulverização acetona na pata do rato e medindo a quantidade de tempo que o rato gasta sacudindo a 3,4 pata. Infelizmente,as respostas a acetona evaporação são confundidos pela sensação molhada e o cheiro da acetona. Além disso, o estímulo frio que é aplicado no teste de acetona evaporação pode variar de acordo com a quantidade de acetona aplicada, e é difícil de quantificar. Finalmente, os ratinhos lesionados têm respostas mínimas para acetona a linha de base, o que torna impossível de medir a analgesia na ausência de hipersensibilidade com este método. Outro ensaio clássico para respostas frias é o ensaio da ponta da cauda, ​​onde a latência para retirada é medida após a cauda está imerso em 5,6 água fria. Enquanto as respostas comportamentais neste ensaio são inequívocos e o ensaio mede as respostas a uma temperatura específica, os animais devem ser imobilizados durante os testes, o que pode alterar a capacidade de resposta fria através bem descritos mecanismos analgésicos estresse induzido por 7. Outra ferramenta utilizada é o teste de placa fria, que mede o comportamentorespostas dos ratos depois de serem colocados sobre uma placa arrefecida com Peltier 8-10. Enquanto esta ferramenta fornece informações sobre as respostas de animais em temperaturas específicas, ele também tem sido usado de forma inconsistente; diferentes grupos foram medidos diferentes tipos de resposta incluindo o número de saltos 8,11, a latência a primeira resposta 8,11- 13, e o número de pata elevadores 11,13,14 com resultados muito diferentes. O teste de placa de frio é também relativamente baixa taxa de transferência uma vez que apenas um animal pode ser testada ao mesmo tempo, e necessitam de um dispositivo de Peltier caros e frágeis. O teste de preferência temperatura 2 placa é um derivado normalmente usado para o teste de placa fria, que mede a quantidade relativa de tempo em que os animais passam em 2 placas conectadas de diferentes temperaturas 9,15- 17. Outro ensaio utilizado é semelhante ao ensaio de gradiente térmico, em que a quantidade de tempo que os ratos passam em diferentes zonas de temperaturavariando entre 5 ° C e 45 ° C em uma placa de metal é medida a longo 16. Enquanto estes ensaios permitir a comparação das temperaturas, não está claro se o comportamento representa aversão temperatura ou a preferência de temperatura. Finalmente, o ensaio de placa fria dinâmica tem sido usado para medir como ratos responder às mudanças nas temperaturas ambiente 18. Este método envolve a colocação de ratos em um dispositivo Peltier RT e aumentando-a para 1 ° C enquanto mede o quanto os ratos saltar ou lamber as patas em diferentes temperaturas de placas. Enquanto isto testa como ratos se adaptar a um ambiente de arrefecimento, ele não fornece uma maneira de testar como os ratos responder a um estímulo frio na definição de uma temperatura ambiente mais fresco. Além disso, requer equipamentos caros para realizar e não fornece uma maneira de se aclimatar ratos para o equipamento de teste antes de medir a sua sensibilidade frio. Para complementar estes ensaios, o CPA testa a ACCLIMAted respostas a um estímulo frio bem definida em uma variedade de faixas de temperatura, ou durante o processo de adaptação a temperaturas ambientes frios. Pode testar-se a 14 ratinhos de cada vez com o nosso aparelho actual, com o potencial de ser barata aumentada a escala para ensaios de elevado rendimento.

<table><tbody><tr><td>T-type thermocouple probe</td><td>Physitemp</td><td>IT-24p</td><td>Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td></tr><tr><td>Glass plate</td><td>Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td><td></td><td>We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4&#039;&#039;, but 3/16&#039;&#039; and 1/8&#039;&#039; are also useful</td></tr><tr><td>Thermal Data logger</td><td>Extech</td><td>EA15</td><td>Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&amp;amp;prodid=408)</td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td>The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe</td></tr><tr><td>Computer</td><td>If using Extech logger, any Pcwill work</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum boxes</td><td>Washington University in St. Louis machine shop</td><td></td><td>boxes are 3&#039; long, 4.5&#039;&#039; wide, and 3&#039;&#039; tall with a sealed lid.&amp;nbsp; There is a 1/2&#039;&#039; hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.</td></tr><tr><td>Heated water circulator</td><td>VWR</td><td></td><td>Any water circulator model with a pump will work</td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>BD</td><td>305165</td><td>The exact needle size is not important</td></tr><tr><td>Hand timer</td><td></td><td></td><td>Any hand timer will work</td></tr><tr><td>Mirror</td><td></td><td></td><td>Any flat mirror will work</td></tr></tbody></table>

a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

As respostas comportamentais induzidos de ratinhos a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C são altamente reprodutível (Figura 4A) 20. A fim de medir o estímulo frio sendo gerado sob a pata traseira, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina / acepromazina e cocktail suas patas foram assegurados no vidro na parte superior de um termopar de tipo T filamento (Figura 4B) 20. O vidro foi arrefecida ou aquecida para a faixa de teste desejada. Embora a placa é arrefecida de maneira uniforme ao longo do comprimento da placa (Figura 5A) 2, deve notar-se que um gradiente de frio é gerada entre os compartimentos de comportamento (Figura 5B) 2. As partes do invólucro que estão mais próximos do gelo seco em ambos os lados dos compartimentos são mais frias, enquanto que as partes centrais são ligeiramente mais quente (Figura 5B) 2. Em temperaturas mais baixas used, os ratos passam a maior parte do seu tempo nas partes centrais do gabinete. Uma vez que a temperatura da placa de vidro tinha estabilizado, um estímulo gelo seco focal foi colocado sobre o vidro por baixo da pata / thermode. Com base nos vestígios de temperatura registadas a partir desta configuração, é evidente que os estímulos frios gerados usando o CPA são altamente reprodutíveis em cada intervalo de temperatura (Figura 4C) 20. O estímulo frio gerado na PCR também foi medida com três espessuras diferentes de vidro para variar a intensidade do arrefecimento (Figura 3). A taxa de arrefecimento está inversamente relacionada com a espessura do vidro, e qualquer destas espessuras podem ser utilizadas para medir a sensibilidade ao frio, conforme necessário (Figura 3). Trabalhos anteriores mostraram que o APG pode detectar a analgesia e hipersensibilidade em ratinhos. 30 min após a injecção subcutânea de 1,5 mg / kg de morfina, os ratos têm significativamente longer latência de retirada de ratinhos que receberam injecções subcutâneas de solução salina (Figura 6A: 2-way ANOVA principal efeito * p &lt;0,05 com Bonferroni post-hoc; 30 min ** p &lt;0,01; n = 12 por grupo) 1. Por 60 min após a morfina / soro fisiológico, não há diferença entre a saline- e grupos de injecção de morfina, o que é consistente com a taxa de metabolismo da morfina em ratos. Adjuvante Completo de Freund (CFA) foi previamente demonstrado que causam inflamação e hipersensibilidade após injecção 21 da pata traseira. Após injecções CFA, as latências de retirada da CPA diminuir 2 e 3 h pós-injecção (Figura 6B: 2-way ANOVA principal efeito p &lt;0,001 com Bonferroni post-hoc de teste; 2 hr * p &lt;0,05, 3 h ** p &lt;0,01 n = 12 por grupo). 4 horas após a injecção de CFA, os ratinhos receberam injecções subcutâneas de 1,5 mg / kg de morfina. 30 min após a injecção de morfina, tanto CFA- e ratinhos injectados com soro fisiológico tinha aumentado withdrawal latências em relação às suas latências em 3 horas (Figura 6B: 1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnett; CFA 3 hr vs. CFA 4,5 hr $$$ p &lt;0,001, salina 3 hr vs. salina 4,5 hr $$$ p &lt;0,001). Uma hora mais tarde, uma vez que a morfina tinha sido metabolizada, os ratinhos injectados com CFA mais uma vez teve latências de retirada mais baixos do que os ratinhos de controlo injectados com soro fisiológico (Figura 6B: 2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p &lt;0,01) 1. A maioria das espécies de mamíferos têm a capacidade de se adaptar a sua sensibilidade à temperatura para coincidir com o seu ambiente. In vitro, estudos têm sugerido que este processo de adaptação depende PIP 2 hidrólise 22- 24, mas as ferramentas comportamentais anteriores não foram capazes de validar essa hipótese in vivo. A A CPA é capaz de quantificar esta adaptação de duas maneiras diferentes. Ao testar a latência de retirada de ratinhos como o vidro arrefece ( <strong&gt; Figura 7A, C), o CPA pode medir a adaptação ao frio, como acontece 2. Em condições normais, a latência de retirada é alterado conforme o prato esfria, o que sugere que a adaptação ao frio acontece mais rápido do que pode ser quantificado com o CPA (Figura 7b: ​​0 min = 12,13 ± 0,8 seg, 30 min = 12,1 ± 1,6 seg, 60 min = 13,2 ± 1,1 seg, 90 min = 10,8 ± 1,2 s 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni p&gt; 0,05, n = 6) 2. No entanto, quando os ratinhos são dadas injecções intraplantar da fosfolipase-C U73122 25 inibidor antes da placa é arrefecida (Figura 7C) suas latências de retirada são diminuídos, sugerindo que a adaptação é prejudicada (Figura 7D: linha de base = 11,29 ± 0,53 sec, 30 min = 8,09 ± 1,17 s; 1-way ANOVA com teste de Dunnett post-hoc, o efeito principal p = 0,02, individuais de linha de base vs. 30 min p = 0,02, n = 9). A CPA também pode medir a abilid a adaptar-se a temperaturas ambientes frios durante longos períodos de tempo. Quando ratinhos do tipo selvagem são testados usando o CPA depois de ter sido aclimatados durante 3 horas a 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C, a latência de retirada é a mesma temperatura em toda a partir, sugerindo que o de tipo selvagem ratos adaptados à temperatura ambiente mais frio (Figura 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 seg, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 segundos, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 seg, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 s, 1- ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, p &lt;0,05 n = 6 para 30 ° C, n = 15 para 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C) 20. Ao contrário dos camundongos selvagens, como a temperatura de partida diminui as latências de retirada de camundongos TRPM8-KO diminuir, sugerindo que eles são incapazes de adaptar o seu limiar de resposta para se adequar ao seu ambiente (Figura 8: 1-way ANOVA de medidas repetidas com Bonferroni pós- teste hoc; machos principal efeito p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C, p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,004; fêmeas principal efeito p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 machos e 11 fêmeas) 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig1.jpg" /> Figura 1. The Cold Plantar Assay (CPA) aparelho 2. (A) Esquema para a realização do CPA. Ratos são aclimatados em uma placa de vidro em caixas plásticas de comportamento até que eles estão em repouso. Um sedimento de gelo seco é aplicado ao lado de baixo do vidro debaixo da pata traseira, e a latência para retirar o vidro de arrefecimento é medido. (B) Imagem do aparelho CPA, em configuração para arrefecer a chapa até 5 ° C. O registrador de dados térmica está no centro das caixas, E as caixas de alumínio flanquear o invólucro em ambos os lados. (C) de imagem do aparelho de CPA, em configuração de aquecer a placa a 30 ° C. O circulador de água flui a água quente para a caixa de alumínio, que, em seguida, flui para fora da fuga no lado de trás para dentro do reservatório da bomba de circulação. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig2.jpg" /> Figura 2. A temperatura da placa de vidro durante o CPA 2. (A) Média de traçados de temperatura da placa de vidro no decurso de experiências comportamentais no CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C, n = 7, 12 ° C, n = 7, 4 ° C n = 5. (B) os diagramas esquemáticos demmonstrando como gerar as diferentes condições de temperatura na CPA. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig3.jpg" /> Figura 3. A espessura do vidro é inversamente correlacionada com a taxa de arrefecimento 1. (A) Esquema de diagramação do projeto experimental (BD). A temperatura durante o estímulo frio debaixo da planta do pé da pata foi medido em todos os três espessuras de vidro sob condições normais, e que os espaçadores de isopor sustentando a pata de distância da superfície do vidro. Em todos os casos, sustentando a pata longe do vidro causou uma diminuição dramática no estímulo frio medida na pata (n = 6 por espessura de vidro). ( <strong&gt; E) A temperatura debaixo da pata foi medido durante Hargreaves estimulação calor radiante com a pata apoiado com isopor. Ao contrário do ensaio plantar frio, o estímulo térmico no ensaio de Hargreaves é basicamente inalterado quando a pata é sustentado fora do vidro (n = 6). Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2012 1 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig4.jpg" /> Figura 4. latências de retirada são consistentes CPA 20. (A) a latência de retirada de ratinhos médio a partir de 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. (B) Configuração para medir CPA estímulo frio. A pata de um rato anestesiado é preso na placa de vidro com fita de laboratório em cimade um filamento de termopar de tipo T. O estímulo de CPA é colocado no lado inferior do vidro debaixo tanto pata e termopar. (C) As temperaturas geradas no CPA a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, ou 12 ° C. As setas pretas representam as latências médias de retirada para os ratos acordados em cada condição. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig5.jpg" /> Figura 5. temperaturas da chapa de vidro são consistentes na CPA 2. (A) Termopar t1 (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento comportamental mais próximo da extremidade direita da placa. Os tra temperaturacings e o gráfico na extremidade direita (t1-t2) mostram temperaturas quase idênticas, t1 e t2 durante todo o decurso da experiência. (B) t1 termopar (preta) foi colocado no centro do prato. T2 termopar (vermelho) foi colocado no compartimento de comportamento central, na parede mais próxima das caixas de alumínio cheio de gelo seco. Os traçados no gráfico de temperatura e na extremidade direita (t1-t2) mostram que existe uma diferença de cerca de 3 ° C entre t1 e t2, uma vez que a chapa tenha atingido uma temperatura estável. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig6.jpg" /> Figura 6. A CPA pode medir analgesia e hipersensibilidade 1. (A) Subcutaneous injecção de 1,5 mg / kg de morfina aumenta a latência de retirada de ratinhos 30 minutos após a injecção (2-way ANOVA com Bonferroni post-hoc, 30 min após injecção ** p &lt;0,01). 60 min após a injecção, não há nenhuma diferença significativa entre os ratos injectados com soro fisiológico e injectados morfina. (B) injecção intraplantar de 10 ul Adjuvante Completo de Freund (CFA) diminui a latência de retirada de ratinhos 2 e 3 h pós-injecção (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01). Todos os ratos receberam injeções subcutâneas de morfina em 4 horas, e todas as latências de retirada em 4,5 horas foram significativamente maiores em comparação com 3 horas (1-way ANOVA com teste post-hoc de Dunnet; $$$ p &lt;0,001). 5,5 horas após a injecção de CFA (1,5 h após a injecção de morfina), os ratinhos injectados com CFA ainda tinham latências de retirada mais baixas do que os ratos injectados com soro fisiológico (2-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni; ** p &lt;0,01). Reutilizado com permissão deBrenner et al. 2012 1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52640/52640fig7.jpg" /> Figura 7. Medição de adaptação ao frio, como a placa de vidro esfria dinamicamente 20. (A) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando. As temperaturas de linha de base são medidos à temperatura ambiente, os recipientes de gelo seco são adicionados à placa, e a latência de retirada é medida como a placa de vidro arrefece. (B) ratinhos de tipo selvagem tem o mesmo como latência de retirada da placa de vidro arrefece, o que sugere que eles se adaptam a temperaturas de arrefecimento mais rápido do que pode ser medido com o CPA (linha de base = 12,8 ± 0,3 seg, 30 min = 13,67 ± 0,9 seg, 60 min = 11,03 ± 1,0 seg, 90 min = 11,31 ± 0,6 seg, n = 3 murganhos; 1-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, não há diferenças significativas entre todos os grupos). (C) Esquema para a realização da CPA como a placa de vidro está esfriando, após intraplantar injeções da U73122 inibidor PLC ou o U73343 composto de controlo. (D) Os ratos têm latências de retirada significativamente mais baixas, enquanto a placa é de arrefecimento após injecção U73122, U73122 sugerindo que interfere com a capacidade de se adaptar a arrefecer temperatura ambiente. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt= &quot;Figure 8&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52640 / 52640fig8.jpg&quot; /&gt; Camundongos Figura 8. TRPM8-KO não se adaptam ao resfriamento ambiental 20 ratos TRPM8-KO têm latências de retirada mais altas do que do tipo selvagem ninhada em todas as temperaturas a partir medidos (2-way ANOVA com teste de Bonferroni post-hoc;. *** P &lt; 0,001). A latência de retirada de camundongos TRPM8-KO também diminui à medida que a temperatura diminui de partida (1-way ANOVA com Bonferroni post-hoc teste; ## p &lt;0,01, ### p &lt;0,001), enquanto não há nenhuma mudança significativa na retirada latência da mesma ninhada de tipo selvagem como as diminuições de temperatura de partida. Reutilizado com permissão de Brenner et al. 2014 20. Esta figura foi reproduzida com a autorização da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). A figura não pode ser reproduzido por qualquer outro fim sem permissão. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52640/52640fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, cliquem</a>k aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

a-simple-inexpensive-method-for-determining-cold-sensitivity

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  Washington University in St. Louis. The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

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Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected with aging and is a strong predictor of neurodegenerative diseases. Thus, olfaction testing is used as a non-invasive diagnostic method to detect neurological deficits early on. In order to understand the mechanisms underlying olfactory network susceptibility, olfactory research in rodents has gained momentum in the past decade.
Here, we present a very simple, time efficient and reproducible olfactory testing method of innate odor perception and sensitivity in mice without the need of any prior food or water restriction. The tests are performed in a familiar environment to the mice, require only the scents and a 2 min session of odorant exposure. The analysis is performed, post-hoc, using computer-assisted commands on ImageJ and can be, therefore, carried out from start to end by one researcher.
This protocol does not require any special hardware or setup and is indicated for any laboratory interested in testing olfactory perception and sensitivity.

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

Comportamento

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Imunologia e Infecção

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Neurociência

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as photophobia. Whilst it is impossible to confirm that a mouse is experiencing migraine, light aversion can be used as a behavioral surrogate for the migraine symptom of photophobia. To test for light aversion, we utilize the light/dark assay to measure the time mice freely choose to spend in either a light or dark environment. The assay has been refined by introducing two critical modifications: pre-exposures to the chamber prior to running the test procedure and adjustable chamber lighting, permitting the use of a range of light intensities from 55 lux to 27,000 lux. Because the choice to spend more time in the dark is also indicative of anxiety, we also utilize a light-independent anxiety test, the open field assay, to distinguish anxiety from light-aversive behavior. Here, we describe a modified test paradigm for the light/dark and open field assays. The application of these assays is described for intraperitoneal injection of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in two mouse strains and for optogenetic brain stimulation studies.

Rodents are not able to report migraine symptoms. Here, we describe a manageable test paradigm (light/dark and open field assays) to measure light aversion, one of the most common and bothersome symptoms in patients with migraines.

Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

Measuring Skeletal Muscle Thermogenesis in Mice and Rats

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. Surprisingly little evidence is available to link the neural, myocellular, and molecular mechanisms of thermogenesis directly to measurable changes in muscle temperature. This paper describes a method in which temperature transponders are utilized to retrieve direct measurements of mouse and rat skeletal muscle temperature.
Remote transponders are surgically implanted within the muscle of mice and rats, and the animals are given time to recover. Mice and rats must then be repeatedly habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage. Muscle temperature can also be measured during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed) to factor out changes in activity as contributors to the changes in muscle temperature induced by these stimuli.
This method has been successfully used to elucidate mechanisms underlying muscle thermogenic control at the level of the brain, sympathetic nervous system, and skeletal muscle. Provided are demonstrations of this success using predator odor (PO; ferret odor) as a contextual stimulus and injections of oxytocin (Oxt) as a pharmacological stimulus, where predator odor induces muscle thermogenesis, and Oxt suppresses muscle temperature. Thus, these datasets display the efficacy of this method in detecting rapid changes in muscle temperature.

Mice and rats are surgically implanted with remote temperature transponders and then habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage or during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed).

Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. ...

Urokinase-type Plasminogen Activator-induced Mouse Back Pain Model

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid induction of a persisting back pain model in mice are provided here using an injection of urokinase-type plasminogen activator (urokinase), a serine protease present in humans and other animals. The methodology for induction of persisting lower back pain in mice involves a simple injection of urokinase along the ligamentous insertion region of the lumbar spine. The urokinase inflammatory agent activates plasminogen to plasmin. Typically, the model can be induced within 10 min and hypersensitivity persists for at least 8 weeks.
Hypersensitivity, gait disturbance, and other standard anxiety- and depression-like measures can be tested in the persisting model.&#160;Back pain is the most prevalent type of pain. To improve awareness of back pain, the International Association for the Study of Pain (IASP) named 2021 the &#34;Global Year about Back Pain&#34; and 2022 the &#34;Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.&#34; One limitation of the therapeutic advancement of pain therapeutics is the lack of suitable models for testing persistent and chronic pain. The&#160;features of this model&#160;are suitable for testing potential therapeutics aimed at the reduction of back pain and its ancillary characteristics, contributing to IASP&#39;s naming 2022 as the Global Year for Translating Pain Knowledge to Practice.

Methods for simple, rapid induction of a back pain model in mice are provided here using an intraligament injection of urinary plasminogen activator.

Modelo de dor nas costas de camundongo induzido pelo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase

A model of persisting lower back pain can be induced in mice with the simple methodology described herein. Step-by-step methods for simple, rapid ...

Explorando a troca de metabólitos no tecido adiposo marrom

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering thermogenesis. To achieve this, BAT utilizes a diverse menu of circulating nutrients to support its high metabolic demand. Additionally, BAT secretes metabolite-derived bioactive factors that can serve as either metabolic fuels or signaling molecules, facilitating BAT-mediated intratissue and/or intertissue communication. This suggests that BAT actively participates in systemic metabolite exchange, an interesting feature that is beginning to be explored. Here, we introduce a protocol for in vivo mouse-level optimized BAT arteriovenous metabolomics. The protocol focuses on relevant methods for thermogenic stimulations and an arteriovenous blood sampling technique using Sulzer's vein, which selectively drains interscapular BAT-derived venous blood and systemic arterial blood. Next, a gas chromatography-based metabolomics protocol using those blood samples is demonstrated. The use of this technique should expand the understanding of BAT-regulated metabolite exchange at the inter-organ level by measuring the net uptake and release of metabolites by BAT.

Autor em destaque: Iluminando novos caminhos para o metabolismo do tecido adiposo e prevenção de doenças 

In this protocol, methods relevant for BAT-optimized arteriovenous metabolomics using GC-MS in a mouse model are outlined. These methods allow for the acquisition of valuable insights into BAT-mediated metabolite exchange at the organismal level.

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Bioquímica

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Resumo

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Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

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Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

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Romance Ensaio para Fria nocicepção em