Name: determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Geração e Validação de Quimeras proteína fluorescente <ol><li> Acrescente proteína fluorescente verde (GFP) para o grupo amino ou carboxilo da proteína de interesse, utilizando as estratégias de ADN recombinante, convencionais 13. NOTA: Embora tenhamos GFP usado extensivamente, outras variantes, tais como a proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed mCherry e podem ser empregues. Melhorias na fluorophore dobrar eficiência, brilho e fotoestabilidade estão sendo feitas constantemente, e os investigadores devem valer-se das últimas construções geração. <ol><li> Confirmar sequência de ADN correcta e assegurar que a porção da GFP é em grelha com a proteína de interesse. Execute sequenciamento utilizando estratégias convencionais de DNA recombinante 21. NOTA: Muitas instituições têm instalações de DNA do núcleo, que o investigador é encorajado a contactar para obter informações adicionais. </li><li> Para proteínas de membrana passe simples ou duplas, gerarambas as versões de terminal amino e carboxilo das proteínas de fusão 19. </li><li> Para as proteínas de multi-GFP abrangendo inserir dentro de laços extramembrane putativos, assim como os terminais. Tomar cuidado especial quando gerar quimeras transmembranares com a proteína de fusão fluorescente ligado ao terminal amino da proteína alvo como sequências de sinal são muitas vezes clivado por proteólise, uma vez que a proteína tenha passado através do translocon ER. </li><li> No caso de sequências de sinal existentes, inserir a proteína de fusão fluorescente distai ao local de clivagem de modo a gerar uma proteína madura contendo uma proteína fluorescente marcado intacta amino-terminal. Empregam estratégias de ADN recombinante padrão para a geração de quimeras 21. </li></ol></li><li> Determinar a presença do sinal fluorescente apropriadamente localizada suficiente na linha celular de interesse. <ol><li> Observe as células sob microscopia de epifluorescência utilizando a fluorescência intrínseca da GFP sob aprocomi filtro definir condições. Para conjuntos de filtros de GFP que englobam 510-560 nm, confirmar que os filtros de correcção são utilizados para o fluoróforo utilizado. NOTA: Um sinal suficiente é alcançada quando a avaliação a olho fornece um sinal forte o suficiente para que a estrutura celular dentro do qual o sinal reside é facilmente resolvido acima do fundo. Além disso, o padrão de coloração da proteína GFP deve ser consistente com a de marcadores para o organelo adequado, e de preferência idêntica à da proteína nativa não marcada. </li></ol></li><li> Determinar se uma abordagem transfecção estável ou transitória será utilizado com base na proteína que está sendo avaliada. NOTA: Os transfectantes estáveis ​​geralmente pagar menores níveis de expressão do que os sistemas transientes. Embora a expressão transitória produz expressão de nível elevado de proteínas e aumento da intensidade de sinal (~ 5-24 horas após a transfecção, dependendo da proteína), mas também pode levar a artefactos, tais como sobre-expressão da proteína aggregation ou saturação da proteína alvo vias, levando a localização subcelular errônea. </li></ol> 2. transfecção de células e Cultura de Células NOTA: Uma variedade de células são passíveis de análise FPP, incluindo Hek293, HeLa, COS-7 e células CHO 14. A descrição a seguir baseia-se na expressão de proteínas de membrana em células Hek293. <ol><li> Crescer as células embrionárias de rim humano (Hek293) como monocamadas aderentes em 6 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com soro a 5% de bovino fetal (FBS), piruvato de sódio a 1%, e 250 ug / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO 2. Realizar todos os trabalhos com células em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô. Cultivar células em meio de cultura até ~ 80% confluentes em um frasco T-75. </li><li> Células transfecção usando qualquer padrão de elevada eficiência, baixo método de transfecção de toxicidade, incluindo lipídeos, tecnologias viral- ou à base de eletroporação para gerar transient ou expressão estável. Tipicamente de 2 ug de DNA de plasmídeo por 1 x 10 6 células proporciona uma boa expressão de proteínas reprodutível. Manter células para 5-48 horas em meio de cultura de tecido apropriado, a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 capaz de cultura de tecidos. </li><li> Monitorar células para expressão da proteína de fusão GFP-usando microscopia de epifluorescência, utilizando o sinal de fluorescência intrínseca da GFP, utilizando conjuntos de filtros adequados de acordo com o protocolo do fabricante. Sinal de fluorescência geralmente atinge um máximo dentro de 24-72 horas após a transfecção. Use células quando o sinal de fluorescência atinge um nível máximo. Monitorizar os níveis de expressão de proteína por análise de imunotransferência utilizando anticorpos dirigidos quer contra a proteína de interesse ou a porção da GFP. </li><li> Para células da placa análise experimentais sobre lamelas revestidas. Ver ou sob uma configuração de células vivas ou após fixação e montagem em lâminas de microscopia. Células da placa para atingir 60% -80% de confluência no período de 24-48 h. <ol><li> Lamelas de revestimento com solução de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda a superfície é coberta. Incubar durante 30 min sob uma luz ultra violeta à temperatura ambiente, seguido de 60 min numa incubadora de cultura de células a 37 ° C. Retire o excesso de poli-lisina e lavar as lamelas em PBS 3 vezes. </li><li> Como alternativa, a chapa células em uma tampa de vidro câmaras que consiste em placas de cultura de célula com um fundo de vidro óptico para permitir imagens diretas com os objetivos de imersão em óleo. A verdadeira configuração microscopia depende do equipamento disponível para o investigador, mas deve ser capaz de mudanças rápidas da solução. Dependendo da forma do tipo de célula e de células, as células devem ser cerca de 60-90% confluentes no momento do ensaio FPP. </li></ol></li></ol> Setup 3. microscopia de fluorescência <ol><li> Use um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) para a coleta de sinal máximo e resolução espacial, como um 60X, 1,42 NA objetivo de imersão em óleo. Use the seguindo lasers para estimular os fluorophores: gás Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 de diodo (RFP, mCherry). </li><li> Determine a taxa de exposição, ganho e captura ideal de imagens para cada construção. Ajuste intensidade do laser e tempo de exposição para minimizar a fotodegradação (veja o passo 7.1.2). </li><li> Para os estudos que utilizam múltiplos fluorophores (por exemplo, um marcador solúvel para permeabilização da membrana em conjunto com um marcador de proteína de membrana), escolha os filtros utilizados para minimizar o sinal de cross-talk e maximizar a relação sinal-ruído. </li></ol> 4. Estabelecer as condições ideais para Plasma Membrane Permeabilização <ol><li> Remover o meio de cultura celular a partir de células expressando apenas proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo EGFP, DsRed). Lavam-se as células 3 vezes (1 min cada) em tampão de KHM (acetato de potássio 110 mM, 3 mM de MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experiências com células e todos os reagentes à temperatura ambiente. </li><li> Coloque células Sn lamelas (veja o passo 2.4) em tampão KHM em um palco microscópio de fluorescência e recolher a primeira imagem, que representa o controle do estágio de &quot;não-permeabilizadas &#39;. </li><li> Para selectivamente permeabilizar a membrana plasmática, adicionar digitonina (30 uM) em tampão de KHM para as células. Perfundir células com tampão (tampão de digitonina +) a um caudal de 5 ml / min durante 10-60 seg. </li><li> Determinar a concentração óptima de digitonina, aumentando gradualmente a concentração de digitonina. A concentração óptima de digitonina é alcançado quando ocorre perda completa do sinal de fluorescência de EGFP solúvel dentro de 10-60 segundos de aplicação de digitonina. Para muitas células aplicação de 10-50 uM de digitonina é suficiente para permeabilizar a membrana celular. <ol><li> Para todos os aplicativos usam a menor concentração possível de digitonina. Coletar imagens após Digitonina permeabilização para sinal de fundo permeabilizada. </li></ol></li><li> Confirme se a quimera GFP-proteína de interesse é na membranagrados confirmando retenção celular do sinal de fluorescência após a permeabilização digitonina da membrana plasmática 16. <ol><li> Expressar uma proteína fluorescente organela específica 23. Proteínas mitocondriais funcionar bem neste aspecto de 16, por exemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar as condições óptimas de expressão, tal como descrito na etapa 2.1. </li><li> Confirmar que a concentração de digitonina é apropriado para o tipo de célula utilizado, assegurando que a morfologia das organelas intracelulares permanece constante ao longo (até 60 minutos) a exposição prolongada a digitonina. NOTA: Use protocolos de microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos padrão contra vários compartimentos celulares, tais como lisossomas (por exemplo, LAMP1), de Golgi (por exemplo, TGN38), retículo endoplasmático (por exemplo, calnexina), endossomas (por exemplo, Rab5), mitocôndria (por exemplo, o citocromo c). Se organela intracelular mudanças morfologia / integridade dramaticamente over 60 min, é provável que a concentração de digitonina era demasiado elevada, e requer uma diminuição na concentração de digitonina e / ou tempo de exposição. NOTA: Digitonin é tóxico por inalação e contato com a pele. Use equipamento de proteção individual (EPI). </li></ol></li></ol> 5. Tratamento de Protease Proteínas Fluorescentes <ol><li> Lavam-se as células em tampão de KHM e, em seguida, adicionar a protease (proteinase K; 50 ug / ml em tampão de KHM) directamente para as células. Perfundir células a uma taxa de fluxo de 5 ml / min utilizando um sistema de perfusão alimentada por gravidade para o banho continuamente preparação. <ol><li> Armazenar as soluções em seringas de 50 ml e um tubo de polietileno ligado reservatórios independentes para um colector com uma única saída na banheira (taxa de fluxo de 5 ml / min). A posição de uma pipeta de sucção para manter um constante (0,5 ml) e volume do banho atingir troca da solução de comutação manual entre reservatórios de perfusão. </li></ol></li><li> Coletar imagens para determinar se o fluorsinal escent persistir ou se degradar. Uma perda de&gt; 90% da intensidade de sinal inicial ao longo de 30-60 seg é consistente com a degradação proteolítica da proteína quimera-GFP (ver Resultados representativos). </li><li> Se nenhuma degradação do sinal é observado com proteinase K, quando essa perda é antecipada, substituir a solução de proteinase K com tripsina (4-8 mM) em tampão de KHM. Se necessário, utilizar uma mistura de proteinase K e tripsina. Não há necessidade para extinguir a actividade da protease. </li></ol> 6. abordagem alternativa para Plasma Proteínas de Membrana com domínios externos <ol><li> Para as proteínas de membrana de plasma, para realizar o ensaio de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonina permeabilização. Lavam-se as células em lamelas em tampão de KHM (5 ml / min x 3 min), e tomar uma imagem para o tratamento de pré-protease e quantificar sinal de fluorescência pré-protease tal como no Passo 7. </li><li> Expor as células de protease (proteinase K; 50 ug / mL ou tripsina 4-8 mM em tampão de KHM) em tele ausência de digitonina em perfundir as células com meio contendo a protease KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min). Coletar imagens da proteína fluorescente, para determinar a rapidez com que o sinal desaparece ou quanto tempo o sinal persiste. </li><li> Antes de permeabilização de digitonina, extingue toda a actividade de protease, por lavagem das células três vezes (1 min cada) em meios de cultura celular contendo 10% de soro (FBS). </li><li> Lavam-se as células com tampão de perfusão por KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min) durante 2 minutos. Adquirir uma imagem de pré-permeabilização. Permeabilizar a membrana da célula, tal como descrito no Passo 4. </li><li> Coletar imagens seguintes disso protease como descrito na Etapa 5. </li></ol> Análise 7. Imagem <ol><li> Usar um microscópio invertido capaz de &quot;célula viva&quot; de gravação, em que a perda de sinal de fluorescência podem ser monitorizadas em tempo real. Para o monitoramento contínuo, empregam parâmetros idênticos (tempo de exposição, ganho de intensidade laser, etc.). <ol><li> Determine experparâmetros imental observando o sinal de fluorescência da GFP-proteína de interesse em condições de controle (ou seja, KBH tampão sozinho). Ajuste as configurações de tempo de ganho, de intensidade do laser e de exposição sobre o microscópio orientada por computador para garantir que não há perda significativa de intensidade de sinal ao longo de um período de 10-20 min. NOTA: A intensidade de sinal não é um valor absoluto, mas baseia-se no sistema de microscópio e configurações disponíveis para cada PI. Monitorar mudanças na intensidade de fluorescência relativa. </li></ol></li><li> Alternativamente, o tratamento de células em conjunto pontos temporais em digitonina seguido de protease, e corrigir as células antes da montagem em lamelas de imagiologia. Determinar pontos de tempo empiricamente seguindo os procedimentos nas etapas 4 e 5. Para a investigação inicial, começam em 0, 30, 60, 120 e 300 além sec cargo de digitonina ou protease. <ol><li> Fix células (20 min) à temperatura ambiente utilizando uma quantidade suficiente de fixador (3,7% de paraformaldeído em PBS) para submergir inteiramente thcélulas e. </li><li> Extingue-se paraformaldeído residual lavando as células com PBS contendo 20 mM de glicina (3 x 5 min). </li><li> Montagem de lamelas, removendo o excesso de líquido da lamela e invertendo a lamela em meios de montagem 50 mL em uma lâmina para a criação de imagens. Permitir slides para secar durante a noite antes de imagem. </li></ol></li><li> Recolhe imagens de microscopia de fluorescência (sob os conjuntos de filtros adequados compatíveis com o fluoróforo ser utilizada), utilizando a função de captação de imagem de vídeo em um computador controlado microscópio de fluorescência. </li><li> Quantificar intensidades do sinal de fluorescência como uma função da condição de incubação. Obter a média de intensidade de pixel dentro de uma região de interesse (ROI) que inclui uma célula individual. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

A orientação correta e topologia de proteínas de membrana é essencial para o seu funcionamento adequado. Apesar da importância de compreender topologia proteína de membrana, existem muitas proteínas para as quais os dados são completamente inexistentes. FPP proporciona uma maneira fácil e eficaz de determinar a topologia de proteína de membrana, e uma que pode ser executado pela maioria dos laboratórios. A abordagem FPP oferece vantagens significativas em relação aos métodos anteriores para determinar a topologia de proteínas. Por exemplo, não há necessidade de ter um painel de vários anticorpos dirigidos novamente vários domínios da proteína de interesse 31. Em muitos casos, um tal painel de anticorpos não está disponível; isso é especialmente verdadeiro para as proteínas recém-clonados. À medida que o ensaio pode ser realizado em um nível de uma única célula, grandes quantidades de proteína bioquímicos não são necessários para as análises bioquímicas a jusante, tais como proteólise ou SDS-PAGE. Com efeito, relativamente poucas células transfectadas são necessários para atribuir inequivocamenteuma topologia para a proteína de interesse. Isto é importante se o investigador avalia em topologia rígidos para transfectar células, tais como células epiteliais ou neurónios. A simples adição de uma porção de GFP, quer ao terminal carboxilo ou amino da proteína pode ser facilmente conseguida utilizando numerosos GFP disponíveis comercialmente contendo plasmídeos, e na maioria dos casos, a adição da porção da GFP não impeça o enrolamento de proteínas adequada ou localização subcelular. No entanto, o investigador deve confirmar que isto é verdade para a proteína, como existe o potencial para afectar a GFP para a proteína de interesse 23,24. Muitas proteínas já estão disponíveis como proteínas de fusão GFP, exigindo, portanto, um esforço adicional mínimo para iniciar estudos topológicos. Embora o monitoramento contínuo de fluorescência fornece um meio rápido e eficiente de determinar a topologia de proteína, para os investigadores que não têm acesso a viver de células equipamentos de imagem, o ensaio é facilmente adaptado para um app fixação em formolroach usando epifluorescência padrão de microscopia confocal. No entanto, existem algumas limitações na aplicabilidade do ensaio FPP. Caso processamento proteolítico, ou outras modificações pós-traducionais resultar em ligeiramente diferentes topologias de membrana para a proteína de interesse, o ensaio de FPP só irá avaliar a forma de proteína dominante. Além disso, adicionando uma porção de GFP para os terminais de algumas proteínas podem afectar a sua função, por exemplo, interferir com os domínios do terminal carboxilo PDZ. No entanto, o ensaio de FPP proporciona uma abordagem simples para estabelecer a orientação e topologia de muitas proteínas de membrana. É fundamental que as experiências iniciais ser realizados para determinar a concentração correcta de digitonina para libertar GFP intracelular solúvel. Se o GFP não se difunde para fora da célula na sequência da aplicação de digitonina, a concentração de digitonina deve ser aumentada gradualmente, para determinar a concentração mínima de recessário para facilitar a libertação. No entanto, muito digitonina vai afetar a morfologia das vesículas intracelulares, cuja integridade deve ser confirmado após a aplicação digitonina. Organelos em algumas células são muito sensíveis e podem necessitar de uma composição tampão mais estabilizadora 25. Se o sinal de fluorescência a partir da quimera a ser avaliado é baixa, seleccionar um único clone com um nível de expressão mais elevado, ou realizando uma expressão transitória, muitas vezes, aumentar a intensidade do sinal para um nível aceitável. Buscando mais recente, plasmídeos mais brilhantes também deve ser considerada com baixa intensidade de sinal. Finalmente, deve ser tomado cuidado para assegurar que a perda de sinal observado é devido à degradação por proteases e não para a fotodegradação de fluoróforos. Reduzir a intensidade de luz e / ou taxa de aquisição vai ajudar a reduzir a fotodegradação.

As membranas de plasma, bem como as numerosas membranas intracelulares, servem como barreiras que separam dois compartimentos aquosos. No caso da membrana do plasma, a separação é entre o exterior e o interior da célula; para organelos intracelulares é entre o citoplasma e o lúmen de organelos. Por exemplo, a membrana do retículo endoplasmático (ER) separa um ambiente oxidante no interior do lúmen do ER de um ambiente redutor citosólica 1. As proteínas da membrana são sintetizadas nos ribossomos associados-ER, e alcançar sua topologia final dentro da membrana ER 2. A aquisição de orientação e topologia de membrana apropriado para proteínas é crítico para a sua função normal. Topologia correcta permite domínios relevantes de proteínas de membrana para interagir com os seus parceiros de ligação, que permite que as modificações pós-traducionais críticos para ocorrer, e, no caso de proteínas de membrana de plasma, permite que a célula interagir com e responder to seu meio ambiente. Para apreciar a função de uma proteína de membrana, é manifesta a necessidade de saber que a proteína é orientada em relação à membrana no interior da qual reside, ou seja, a sua topologia de membrana. Além disso a aquisição de conhecimentos científicos básicos, compreendendo a topologia de uma proteína de membrana e que aspectos da superfície de uma proteína são expostos a ambientes diferentes marcou implicações clínicas, uma vez as proteínas da membrana são a maioria dos alvos farmacológicos 3. Até recentemente, abordagens para determinar topologia proteína de membrana têm exigido um investimento considerável de tempo e dinheiro ou ter exigido reagentes que são difíceis de encontrar. Ambas abordagens experimentais e in silico foram empregues para determinar a topologia de membrana de proteínas residentes no interior da membrana plasmática. Desde as primeiras previsões de membrana que mede domínios com base na hidrofobicidade avaliada de indiviaminoácidos dupla 3, inúmeros algoritmos de previsão estão agora disponíveis na internet, e simplesmente exigem o conhecimento da seqüência de aminoácidos da proteína. No entanto, as hipóteses são muitas vezes central para tais programas de modelagem, premissas que podem levar a atribuições incorretas de topologia de 4,5. Além disso, embora estas previsões baseadas em computador pode atribuir provisoriamente membrana regiões que abrangem, eles não sempre determinar se o amino ou carboxi de proteínas estão no citoplasma, lumen organela ou exterior da célula. Mesmo com o aumento do poder computacional, e o uso de algoritmos de aprendizado de máquina 6, esses dados ainda é um modelo, e deve ser validada experimentalmente usando dados adquiridos. Determinação experimental direta de topologia membrana foi realizada por meio de painéis de anticorpos monoclonais com epitopos conhecidos distribuídos em toda a proteína, em que a avaliação da imunorreatividade foi feita antes e após a permeabilização celular. Esteabordagem requer um conjunto de anticorpos, que podem não estar disponíveis para a proteína de interesse. Uma estratégia alternativa é projectar tais como marcadores de epitopo myc ou de hemaglutinina (HA) em vários locais da proteína, novamente seguido de determinação da imunorreactividade antes e após a permeabilização da membrana. Além de marcas imunogênicas, etiquetas enzimáticas (incluindo fosfatase alcalina, β-galactosidase, β-lactamase ou) e de modificações químicas, como a digitalização de cisteína têm sido empregados para determinar a topologia de proteína de membrana 7,8. Um método adicional utilizado para mapeamento topológico de proteínas da membrana plasmática depende de uma abordagem um pouco diferente para marcadores de epitopo. Neste método, a sequência de marcador é a sequência de consenso de glicosilação ligada a N NXS / T. Uma vez que a glicosilação ocorre apenas quando uma tal sequência está presente no lúmen da via biossintética, a presença do marcador numa relação luminalum compartimento citosólico é facilmente observado como um deslocamento de massa em géis de SDS-PAGE. Tal abordagem foi aplicada ao canal iónico multispanning CFTR 9. Enquanto todas essas abordagens têm sido utilizados, é claro que todos eles exigem investimentos consideráveis ​​em biologia molecular para gerar e seqüenciar as construções múltiplas. Para determinar informações topológicas sobre proteínas transmembrana localizados dentro organelas intracelulares provou ser mais desafiador. A aplicação de tecnologias baseadas fluorescência no entanto, fez com que a determinação da topologia da membrana muito mais simples. A técnica de fluorescência bimolecular complementação (BiFC) baseia-se na interacção entre dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente, restaurando as propriedades fluorescentes de que a proteína de 10. Embora inicialmente descritos para determinar as interacções proteína-proteína in vivo 10, esta abordagem também foi utilizadapara determinar a topologia de proteína de membrana em células de plantas 11. No entanto, esta abordagem também é demorada, uma vez que requer a geração não só de proteínas de fusão com a proteína de interesse, mas também uma variedade de proteínas de fusão, dirigidos às citosol ou organelos lúmen, e requer o conhecimento de que membranas intracelular da proteína de interesse reside . Uma abordagem mais simples para determinar a topologia alternativa de proteína de membrana 12 tem sido descrita. O ensaio de Fluorescência Protease Protecção (FPP) requer a geração de uma proteína de fusão entre o GFP e o gene de interesse. A abordagem é baseada na acessibilidade relativa de proteases não específicas para a porção da GFP; dependendo se GFP é protegido contra a proteólise por residente no lúmen das organelas intracelulares ou está exposta a proteólise por estar presente no citosol. Assim, se a porção da GFP na proteína de interesse está virado para o citoplasma, que será exposto aa actividade da protease e o sinal de fluorescência perdido. Por outro lado, se a porção da GFP na proteína de interesse enfrenta um ambiente &quot;protegidos&quot; de protease (tais como o lúmen de Golgi), então o sinal de fluorescência irão persistir. Para permitir que as proteases para entrar na célula, mas não entrar compartimentos membranares intracelulares a ligação colesterol digitonina droga é usada. O colesterol é o esterol dominante em vertebrados, e é especificamente enriquecido em membrana plasmática em relação aos compartimentos intracelulares. A toxina glicósido, digitonina, é extraído a partir da planta Digitalis purpurea. Digitonina tem uma afinidade para as membranas ricas de colesterol, onde se leva a membrana selectiva permeabiliztion 14,16 (Figura 1). Além de permitir a saída de pequenos componentes citosólicos, permeabilização digitonina também permite a entrada de moléculas exógenas, tais como a proteinase K ou tripsina. O protocolo FPP aproveita o fact que a membrana plasmática contém até 80% de colesterol celular 17, ao passo que outros organelos, tais como o ER, Golgi, endossomas, mitocôndrias, que têm muito baixo teor de colesterol, 14 permanecem intactos. A incorporação selectiva do colesterol pela membrana de plasma tem sido observada em muitas células eucariotas, permitindo a utilização de permeabilização da membrana do plasma dependentes de digitonina em diversas espécies eucarióticas tais como S. cerevisiae para humano 14,18. O ensaio de FPP proporciona um meio simples, rápido e relativamente robustos de determinar (a) se uma proteína ligada à membrana é / ou associados livremente difusivel no citosol e (b) que domínio de uma proteína de membrana enfrenta o citosol ou organelos lúmen. No caso de uma proteína da membrana tem múltiplas orientações, o sinal vai surgir a partir da forma dominante e formas menores não serão detectados. Embora possa haver alguma preocupação de que a adição de uma porção de GFP para a proteína de interesse pode afectar a sua função e/ Ou localização subcelular, este é, na verdade, mais teórica do que real. Com efeito, muitos estudos mostraram claramente que o tag de GFP não alterar as propriedades da proteína 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

A permeabilização da membrana plasmática Permeabilização da membrana plasmática eficiente é determinada pela utilização de proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo, GFP, DsRed) (Passo 4). Estas proteínas, quando expressa nas células, são livres de se difundir no citosol, e são perdidos quando a membrana plasmática é permeabilizadas utilizando digitonina (Figura 2). Um completo desaparecimento do sinal fluorescente deve ocorrer dentro de 10-60 segundos de aplicação de digitonina. A confirmação de que a proteína de interesse está associada com organelas intracelulares é conseguido anotando a retenção do sinal fluorescente seguinte permeabilização digitonina. O tratamento de protease Após a geração bem sucedida de quimeras fluorescentes entre a proteína de interesse e a proteína fluorescente (GFP, YFP, etc.) (Passo 1) e a expressão da proteína fluorescente em células (Passo 2), tratamento<html> células de permeabilizadas com protease proporcionará informação sobre se o fluoróforo (e o seu domínio de proteína adjacente) estão no citosol e acessível para a digestão da protease, ou estão localizados dentro de um lúmen de organelos e portanto protegida contra a digestão da protease (Passo 4). LMTK2 é uma membrana ancorada cinase 15, e ensaios de protecção de protease de fluorescência foram utilizados para determinar a topologia de membrana 16. A cauda carboxilo do LMTK2 foi fundido a GFP e expressa transitoriamente. Sinal LMTK2-GFP fluorescente foi rapidamente perdida após a adição de proteinase K, indicando a localização do terminal carboxilo de LMTK2 estar localizado dentro do citosol (Figura 3). Caveolina-GFP (CAV1-GFP) 17 é uma proteína da membrana do plasma com uma GFP-radical ligado ao domínio citosólico. Tal como acontece com LMTK2, o sinal de caveolin-YFP é digitonina insensível, mas sensível à subsequente adição de protease (Figura 3). t &quot;&gt; Luminal proteínas solúveis também podem ser identificados utilizando o protocolo de FPP. Neste exemplo, o sinal de retenção no RE KDEL é anexado ao DsRed. Em contraste com os sinais de LMTK2 e caveolin, o sinal do KDEL-DsRed é insensível a ambos digitonina e protease, como a digitonina é incapaz de permeabilizar a membrana do RE e o sinal fluorescente é protegido da degradação por proteases. Um exemplo de um domínio membrana localizado no interior do lúmen de um organelo é dada pela proteína mitocondrial é subunidade VIII da citocromo c oxidase humana 18,19. pDsRed-Mit, codifica a proteína fluorescente vermelha de Discosoma sp. fundido com sequência de direccionamento mitocondrial de citocromo c oxidase. Em células que expressam pDsRed-Mito, sendo o sinal fluorescente visto na célula. Seguindo permeabilização digitonina, o sinal fluorescente associado com pDSRed-Mito permanece estável. Além disso, a seguir à adição de proteinase K, a fluorescência associada com pDsRed-Mito persistir, consistente com o fluoróforo na mitocôndria e não expostas ao citosol e, assim, protegido contra a actividade da protease (Figura 3). Domínios extracelulares Tratamento com protease de células não-permeabilizadas deve rapidamente extinguir o sinal de fluorescência quando a porção fluorescente ligada a uma proteína de membrana está de frente para o exterior da célula. O glycosylphosphatidylinositol (GPI) da proteína ancorada PrP 20 serve como um excelente exemplo. Uma construção que contém a proteína fluorescente amarela (YFP) ligado ao terminal amino da PrP (PrP-YFP) 21,22, uma oferta generosa do Dr. Ehud Cohen, de Hebrew University of Jerusalém. Antes do tratamento de protease, o sinal fluorescente do YFP extracelular era brilhante (Figura 4). Após tratamento com protease, o sinal de fluorescência extracelular desapareceu rapidamente. Considerações Tempo <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Passo 2 requer uma hora para contagem de células, transfecção e placas, além de 6-24 horas para detectar a expressão de proteínas em células transfectadas. Passos 4-6 requerem cerca de 20-30 minutos por lamela para coleção de imagens de pré-tratamento, digitonina e protease adições. Passo 7, análise de dados, e quantificação de sinal exigir um novo 10-30 min por amostra. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52509/52509fig1.jpg" /> Figura 1: a permeabilização selectiva da membrana plasmática (a) Modelo de desenhos animados do ensaio FPP mostrando uma única célula a atravessar o protocolo experimental.. O símbolo vermelho representa proteína fluorescente vermelha (RFP) no citoplasma, os símbolos verdes e azuis representam proteínas transmembrana com a tag fluorescente ou de frente para o lúmen de organelas (azul) ou citosol (verde). (B) Na sequência de permeabilização digitonina, cytosolic livreproteínas difundir distância, reduzindo o sinal de RFP. (C) Após a aplicação de proteinase K, o sinal verde citosólica é degradada, enquanto que o sinal azul está protegido contra a degradação pela sua presença no lúmen de organelos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52509/52509fig2.jpg" /> Figura 2: A digitonina tratamento permeabiliza a membrana plasmática e libertação de GFP citosólica (a), dos desenhos de uma única célula que expressa a GFP solúvel, antes e depois do tratamento de digitonina.. (B) tratamento digitonina permeabiliza a membrana plasmática e libertação de GFP citosólica. A região de interesse (ROI) é desenhado em torno de células CHO expressando GFP solúvel. Após o tratamento com digitonina (50 uM), as imagens foram tiradas antes e depois da adição de digitonina, e nos pontos de tempo indicados. Barra de escala, 10 um. (C) A quantificação do fluoréintensidades scence do tempo-série completa (FA) é mostrado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52509/52509fig3.jpg" /> Figura 3: FPP revela a topologia da LMTK2 proteína endosomal (a) dos desenhos animados da FPP mostrando perda de DsRed (bolas vermelhas), mas a retenção de LMTK2-GFP (bolas verdes) após permeabilização digitonina, seguido de perda de sinal sobre o pedido de proteinase K. . (b) ensaio FPP de células CHO expressando DsRed e LMTK2-GFP. As imagens foram tiradas antes e depois do tratamento com digitonina, e proteinase K a seguir, como indicado. Barra de escala: 10 ^ m. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52509/52509fig4.jpg" /> Figura 4: (a) O modelo dos desenhos que mostra a topologia e localização do YFP-PrP (verde) antes e após o tratamento com proteinase K. As células CHO que expressamYFP-PrP foram submetidos a proteinase K durante 100 segundos. (B) As imagens tomadas antes e após o tratamento protease são mostrados nos tempos indicados. Sinal YFP-PrP foi completamente perdida seguinte proteases na ausência de digitonina. Mostra região Amarelo de interesse (ROI) utilizado para a quantificação mostrado em (c).

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K visualizações.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies against specific peptides within the predicted sequence allow some localization experiments. However, other possible interactions with the antibodies often cannot be excluded. This situation provided an opportunity to develop a set of assays dependent on the protein sequence. Specifically, a construct containing the gene sequence coupled to the GFP coding sequence at the C-terminal end of the protein was obtained and employed for these purposes. Experiments to characterize localization, ligand affinity, and gain of function were originally designed and carried out to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor1. In addition, the construct can be employed for studies addressing membrane topology questions and detailed protein-ligand interactions. The present report presents a range of experimental protocols based on the GFP-TMEM184A construct expressed in vascular cells that could easily be adapted for other novel proteins.

A construct encoding TMEM184A with a GFP tag at the carboxy-terminus designed for eukaryotic expression, was employed in assays designed to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor in vascular cells.

Usando um TMEM184A GFP Construir para a confirmação da Heparina Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Genética

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Bioengenharia

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biologia

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Cromatografia de exclusão de tamanho por detecção de fluorescência: uma técnica para identificar a integridade de proteínas de membrana fluorescente após solubilização de detergente

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
In this ...

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

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