Name: development of an in vitro model system for studying the interaction of equus caballus ige with its high-affinity receptor fcεri
Uploaded: 2014-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
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The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.

1) Preparação de Linha de Células: <ol><li> O desenvolvimento da linha celular RBL-2H3.1 expressando α FcsRI eqüinos: <ol><li> Usando técnicas básicas de cultura de tecidos para linhas de células em monocamada, transfectar células RBL-2H3.1 parental usando o plasmídeo pEE6, que transporta o gene equina FceRIa (GenBank: Y18204.1) 28. Adicionar 2 ug -1 ul do DNA de plasmídeo a 0,8 ml de células a uma densidade de 1,2 x 10 7 células mL @ 1. Electroporate as células a 250 V, 960 uF utilizando um 0,4 centímetros electrocuvette depois incubar imediatamente em gelo durante 10 min. </li><li> Selecione as células transformadas utilizando meios contendo 0,4 g de sulfato de geneticina G418, em seguida, classificar as restantes células vivas através FACS por marcá-los com um anticorpo IgE fluorescente. Use o RBL-2H3.1 resultando expressar eqüinos linha celular FceRIa para a investigação 2, 3. </li></ol></li><li> Pré-ensaio de anticorpo de sensibilização: <ol><li&gt; Colheita da RBL-2H3.1 expressando células eqüinos FceRIa de um confluente placa de Petri. Lavar em seguida, re-suspender as células em meio de cultura a uma densidade celular de 5x10 5 células ml -1. </li><li> Adicionar a IgE de interesse para as células suspensas a uma concentração final de 1 ng mL-1, em seguida, a placa 100 ul de células numa placa de 96 poços em colunas 1-6 e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 + 90% humidade relativa durante 16 horas. Após o tempo de incubação, e antes de realizar o ensaio de libertação, verificar os poços sob um microscópio para o bem de confluência e aderência celular. </li></ol></li></ol> 2) Lançamento de Ensaio: <ol><li> Lavar as células: <ol><li> Tampão de libertação Quente (PIPES 25 mM, cloreto de sódio 120 mM, cloreto de potássio 5 mM, cloreto de magnésio 0,04 mM e 1 mM de cloreto de cálcio) a 37 ° C para permitir uma lavagem das células suavemente. </li><li> Lave as células sacudindo a placa para remover a mídia de células e adicionar 100 ml quente, 37 ° C, tampão de libertação. Repita duas vezes. </li></ol></li><li> Desafio Antígeno: <ol><li> Prepara-se uma diluição em série do antigénio (NIP-HSA ou DNP-HSA) de 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml-1, 10 ng mL-1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml-1 em tampão de liberação e quente a 37 ° C. </li><li> Após a segunda lavagem das células, os meios de descarte e substituído por 100 ul das soluções de antigénio. Certifique-se de que os poços de uma mesma fila (A1-6 por exemplo) têm a mesma concentração de antigénio adicionados a eles. </li><li> Configurar um controle negativo na linha A, adicionando 0 ng antígeno -1 ml. Adicionar o aumento da concentração de antigénio para baixo as linhas (BG), seguido de triton x-tampão (5% de Triton X-100) H em células de linha para lisar as células a serem utilizadas como um controlo positivo. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos para permitir que as células de libertar os seus mediadores. </li></ol></li><li> Configurar controles bem individuais: <ol><li> Após a incubação, transferir 50 ul de sobrenadante de célula para a outra metade dos poços (placa de poços A1-6 A7-12, etc). Descartar as restantes 50 ul de sobrenadante e substituir com 50 ul de Triton-x tampão para permitir a medição da quantidade de mediadores libertados em cada cavidade nas colunas 7-12 como uma percentagem do total de mediadores no interior das células na coluna 1-6 . </li></ol></li><li> O substrato enzimático: </li><li> Adicionar 50 ul de substrato β-hexosaminidase (50 mM de 4-nitrofenilo N-acetil-β-D-glucosaminida preparado em DMSO diluídos até 2 mM, adicionando-o ao tampão de citrato ácido cítrico 0,2 M e 0,2 M de acetato de sódio, pH 4,5) a todos os poços para facilitar a conversão do substrato a 4-nitrofenol pela enzima β-hexosaminidase. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 horas. </li></ol><img alt="Figura 2.4.1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig241.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; <ol start="5"><li> Encerrando a reação: <ol><li> Parar a reacção pela adição de 150 ul de tampão Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a cada poço como o elevado pH do tampão de pára a reacção e transforma o 4-nitrofenol em uma cor amarela. </li></ol></li><li> Lendo e analisando os resultados: <ol><li> Ler a placa utilizando uma placa espectrofotómetro a 405 nm para medir a absorvência da cor amarela. Calculado a percentagem de β-hexosaminidase libertada utilizando a seguinte fórmula: </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2.6.1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig261.jpg" width="100" /><ol start="2"><li> Aplicar esta fórmula para cada poço, após o que é feita uma média para cada linha. A1 e A7 representam a localização dos poços da placa de 96 poços. Traçar uma curva de porcentagem de liberação β-hexosaminidase (o que corresponde a total liberação de mediador) açaíantígeno nst concentração 2, 3. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests in this paper.

Em resumo, os resultados desta investigação mostraram que, quando as células RBL-2H3.1 expressando FceRIa eqüinos são sensibilizados com IgE eqüinos e desafiado por um antígeno, eles dão um pico de liberação mediador de 36,68% ± 4,88% do montante total de mediador dentro do As células, em comparação com o RBL-2H3.1 células parentais não expressam eqüinos FceRIa. Assim, este ensaio fornece uma ferramenta útil para investigar e estudar respostas alérgicas eqüinos in vitro. Sua permite a determinação da quantidade de mediador libertado pelas células de mastócitos / basófilos linhagem e, assim, pode ser esperado para o avanço da pesquisa na alergia equina, se avaliar agentes que causam a alergia, ou pesquisando a IgE / receptor de agentes de bloqueio. Este ensaio foi modificado para estudar alergia eqüinos de publicações anteriores que utilizaram para estudar alergias humanos e caninos 4529 para os mesmos fins. A linha de células de engenharias expressando humana e FceRIa caninas foram utilizados para estudar a eficácia e segurança de agentes de bloqueio de alergia, tais como vacinas que visam a inibição da interacção de IgE / receptor 30. A investigação revelou um efeito colateral anafilactogénico de imunogénios compreendendo todo o domínio Ce3, que também foi proposto por outros como uma vacina para atenuar as respostas alérgicas mediadas por IgE, em 24 cães. Com base na nossa investigação, a base molecular para esta complicação potencialmente grave poderia ser racionalizado com base no reconhecimento de epitopos no anticorpo IgE pelo soro imune anti-IgE contendo anticorpos anti-IgE que têm como alvo epitopos em Ce3 e não são obscurecidos, quando a IgE é complexado com o seu receptor. Esta observação não poderia ter sido feita na ausência do presente sistema de ensaio e é, em contraste marcante com a investigação por 24, que também investigou a estratégia de intervenção anti-alergia com base em in vivo immunização com domínios Ce3, mas não têm discutido a segurança da estratégia devido à ausência de um tal ensaio. Os passos críticos do presente protocolo é o de assegurar que a maioria das células RBL-2H3.1 são do fenótipo secretor; Tendo as células em cultura superior a 10 semanas faz com que eles começam a deriva para o fenótipo não-secretoras de 27, independentemente de eles manifestaram a FceRIa clonado de interesse ou não. Por isso, é sempre essencial para executar controlos positivos de IgE de rato juntamente com a experiência (Figura 1), e para manter uma grande massa congelada de células secretoras. Além disso, o pH de todos os buffers devem ser precisos ou arriscam-se a dar resultados falso-negativos; prolongamento do tempo de vida de tampões altera o seu pH, e, assim, qualquer tampão com idade superior a dois meses tem de ser descartado. A técnica mostra a interacção de um produto químico com o ce RBL-2H3.1lls, e como ele promove ou suprime, a sua liberação do mediador in vitro. Esta é uma boa indicação do que pode acontecer in vivo, portanto, este protocolo é um passo essencial quando pesquisando estratégias terapêuticas anti-alérgicos potenciais. A técnica não significa, no entanto, indicam que parte do complexo anticorpo / receptor de a molécula de interesse interage com. Outro trabalho de pesquisa, tais como 20 indicaram que equinos RAO não está relacionado com IgE mediação, razão pela qual alguma discrepância pode ser visto com outros editores, como Moran 31 et al. Ao usar soro eqüino total a testar a influxo de Ca2 + a partir de RAO sofrendo cavalos utilizando anticorpos reaginic inespecíficos, para que diferentes anticorpos seriam responsáveis ​​pelo celular influxo de Ca2 +. Este ensaio é específico para hypersensitivities mediadas por IgE, o que também pode ser aplicado a outros microorganismos, tais como os seres humanos edogs 29, e especificamente utilizado para testar a segurança de estratégias de intervenção anti-alérgicos, tais como anticorpos quiméricos sintéticos / anti-alérgicos 30.

Alergia é conhecida há milênios. Um tratamento da asma foi descrita no texto médico egípcio antigo conhecido como o Papiro de Ebers (~ 1.550 aC) e discutido ervas remédios para tratá-la 7. Hoje alergia é classificada como uma resposta de hipersensibilidade do tipo I, em que o tipo de célula T helper 2 (TH 2) o braço do sistema imunitário dirige a produção de (IgE) anticorpos imunoglobulina E em resposta a antigénios ambientais chamados alérgenos. Estes são diversas substâncias que normalmente interagem com as células do sistema imunológico e estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 e interleucina-13 8, 9, conforme se em partículas do fumo do cigarro ou do escape de diesel de partículas que aumentam a síntese de IgE 10. O aumento nas manifestações alérgicas em países industrializados nos últimos 50 anos, tem sido atribuída a uma combinação do efeito depoluentes ambientais e uma tendência para um ambiente mais higienizado, que combinam a mudar a resposta imunológica para um perfil predominou por TH duas citocinas, tal como proposto pelo &quot;Hipótese da Higiene&quot; 11. Como mencionado acima, os seres humanos não são os únicos mamíferos afetados por alergia. Notavelmente cavalos e cães também podem desenvolver reações alérgicas clássicos e um estudo de 12 mostrou que, como nos seres humanos, a alergia eqüina é atribuída a fatores genéticos e ambientais. Como consequência, esses animais apresentam bons modelos para o estudo da interação entre causas genéticas e ambientais de alergia, a sua progressão de sensibilização para a doença, e as possíveis estratégias de intervenção uma vez que as manifestações clínicas definidas em Em 1887, Stömmer foi a primeira pessoa a descrever a semelhança entre o ser humano e asma equina 13, o efeito da histamina sobre o sistema cardiovascular é equinamuito semelhante à dos seres humanos 14. Cavalos também são a pedra angular da indústria de corridas a cavalo, que vale US $ 72 bilhões, com um volume de apostas de US $ 115 bilhões por ano 15. A maioria dos cavalos de corrida contemporâneos são descendentes do pequeno número de cavalos árabes criados por Lady Anne Blunt de 1878 em diante. Cavalos de corrida modernos são comumente pura a escolha de habilidades de desempenho. Eles são propensas a doenças genéticas, uma das quais é a sua susceptibilidade para montar respostas alérgicas. Eles também têm mil vezes mais altos níveis séricos de IgE do que até mesmo os mais severamente alérgica seres humanos 16. Respostas alérgicas cavalo são geralmente se manifesta como hipersensibilidade picada de inseto (IBH) 17, 18. Resultados IBH na dermatite devido a picadas de insetos formam no gênero Culicoides. Outra forma de doença alérgica eqüina é obstruções das vias respiratórias recorrentes (RAO), isso se manifesta nos pulmões e vias respiratórias. É caracterizada por chiado e laboratóriorespiração ORed. RAO comumente ocorre em resposta a esporos, e altos níveis de IgE alérgeno-específicos foram registrados em cavalos que sofrem de RAO em um estudo de 19, embora outra investigação não confirmou esta 20. Estudos sobre alergia equina girado em torno da tentativa de controlar e neutralizar equina IgE através do desenvolvimento de anticorpos monoclonais anti-IgE equino (mAbs) 21, 22. Além disso, o estudo de 23 discute a produção dos domínios extracelulares de α o de elevada afinidade do receptor de Fc equina cadeia (FceRIa) receptor, na tentativa de detectar e quantificar soro eqüino IgE. Um estudo relacionado por Ledin 24 discute uma nova abordagem visando neutralizar IgE soro por priming do sistema imunológico através de um auto / não-auto imunógeno. Todos estes estudos, no entanto, faltava um ensaio eficaz para testar a segurança e eficácia dos seus protocolos. Neste artigo, vamos agora apresentar tal sys ensaiotempe aplicável ao estudo de estratégias de diagnóstico e terapêuticos relevantes para o sistema equina, onde libertação β-hexosaminidase, como um indicador de mediador de células desgranulação, foi avaliada em células RBL-2H3.1 expressam equina FceRIa. Este protocolo baseia-se em publicações anteriores 25, 4, 5, 2, 3 descrevem a engenharia de células RBL transfectadas com o gene que codifica o domínio de ligação do receptor de IgE de alta afinidade para IgE a partir de espécies diferentes. O protocolo explica como realizar um ensaio de libertação de β-hexosaminidase, cujos resultados são apresentados como a média ± desvio padrão de experiências em triplicado. O ensaio de liberação foi desenvolvido pela primeira vez por Siraganian e Gancho 25 para estudar alergia humano. O grupo de laboratório liderado pelo Dr. Reuben Siraganian também desenvolveu a linha de células RBL. Estas células RBL foram desenvolvidos para expressar o FceRIa humana e o protocolo foi publicada por 4. A peça finaldo ensaio de veio com o desenvolvimento do plasmídeo pSV no papel por Neuberger 26, que descreveu a produção de anticorpos IgE por uma clonagem do seu gene de cadeia pesada a jusante de um gene de rato para uma região variável de IgE que tem como alvo o hapteno 4-hidroxi-3 -nitro-fenacetilo (NP), o anticorpo quimérico resultante era totalmente funcional. A capacidade de desenvolver qualquer IgE direccionamento do mesmo hapteno, ao mesmo tempo, a clonagem do seu receptor na superfície das células RBL resultaram na padronização do ensaio tornando-se um protocolo útil para medir a desgranulação de basófilos. O ensaio tem prós e contras. As vantagens do ensaio é a sua adaptabilidade para ser utilizado em qualquer sistema de mamífero, o nosso laboratório tem, assim, usou-o para testar para a desgranulação nos sistemas humanos, caninos e equinos, e isso pode ser conseguido simplesmente através da síntese de IgE do organismo e a clonagem do seu receptor sobre a superfície das células RBL. Por outro lado,os contras do ensaio é que as células RBL são muito sensíveis a alterações térmicas, mecânicas e de PH, tornando-os dão uma variação de níveis de degranulação dentro do mesmo ensaio. É, portanto, altamente recomendável que os ensaios são sempre repetidas em triplicata e, em seguida, uma média é tomada a partir delas. Além disso, as células RBL tendem a deslocar para um fenótipo de não desprendimento, se forem deixados em cultura de tecidos durante tempos prolongados (&gt; 10 semanas) 27, tornando complicada a sua manutenção. Eles também são propensos a infecções por micoplasma, bactérias que não são visíveis a partir de um microscópio de luz e não modificam a morfologia da célula, mas iria alterar drasticamente os seus níveis de degranulação. Assim, são necessários testes de micoplasma regulares.

<table><tbody><tr><td>RBL-2H3.1 Expressing Equine Fc&amp;epsilon;RI&amp;alpha;</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab</td></tr><tr><td>Equine IgE anti NIP-HSA</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab</td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3595</td><td>-</td></tr><tr><td>Multi Channel Pipette</td><td>Anachem</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Galaxy R</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid</td><td>Cambridge Research Biochemicals</td><td>N-1070-1</td><td>NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab</td></tr><tr><td>Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A6661</td><td>Abbreviated DNP-HSA</td></tr><tr><td>Plate Spectrophotometer</td><td>Anthos Labtec HT2</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>-</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>-</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>-</td></tr><tr><td>4-nitrophenyl N-acetyl-&amp;beta;-D-glucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>Stock solution called &amp;beta;-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>-</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma</td><td>S7670</td><td>-</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>-</td></tr></tbody></table>

development of an in vitro model system for studying the interaction of equus caballus ige with its high-affinity receptor fc&#949;ri

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

As células RBL-2H3.1 parentais e as transfectadas com o gene do receptor de FceRIa equino foram sensibilizados primeiro com IgE de murganho anti DNP-HSA e desafiados com o antigénio DNP-HSA. Rato IgE se liga ao receptor endógeno de rato em ambas as linhas de células e, assim, actua como um controlo para testar a viabilidade de libertação de ambas as linhas celulares para libertar mediadores (Figura 1 A). Esta é uma verificação importante e deve ser levada a cabo rotineiramente desde cima prolongadas (&gt; 10 semanas) a passagem em cultura de células, as células RBL-2H3.1 deriva para o fenótipo não-secretor de 27. As células parentais suportado um pico de libertação mediador de 51,54% ± 4,79%, enquanto que as células que expressam o receptor FceRIa equina teve um pico de libertação mediador de 45,99% ± 5,76%. Estas linhas celulares mesmos onde então sensibilizadas com eqüinos IgE anti NIP-HSA e desafiados com o antígeno NIP-HSA (Figura 1 B). Células parentais não foram submetidos a liberação do mediador, uma vez que oA IgE equino não se ligar ao receptor endógeno de rato. Por outro lado, como era esperado, as células RBL-2H3.1 que expressam o receptor FceRIa equino foram submetidos a libertação de mediador quando sensibilizados com IgE equino anti-NIP HSA e desafiados com o antigénio NIP-HSA, dando um pico de libertação de 36,68% ± 4,88% . Estes resultados confirmam a eficiência deste protocolo ensaio de liberação na investigação da liberação do mediador via receptor IgE eqüinos. Isso mostra que esta linha celular é uma ferramenta de diagnóstico útil na busca de jumentos Novas estratégias de intervenção terapêutica em alergia eqüinos in vitro, reduzindo a necessidade de experimentação animal. O mesmo protocolo é também aplicável a células RBL-2H3.1 transfectadas com o FceRIa receptores humanos e caninos. Este protocolo foi também utilizado para testar a segurança de uma estratégia de imunização potencial que tenta neutralizar soro canino anticorpos IgE 30. A partir dos resultadosna (Figura 2) pode ser determinado que a estratégia de imunização não é seguro. O soro anti-canino-IgE ligada com sucesso para a IgE canina como foi originalmente destinado a fim de neutralizar a IgE do soro e de impedi-lo de ligação para o seu receptor. Mas esta ligação foi inespecífico, e, assim, a cruz de soro anti-IgE ligada ao receptor na superfície das células, resultando na libertação de mediadores, potencialmente resultando em choque anafiláctico se esta estratégia de imunização foi utilizado como uma vacina anti-alergia. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RBL-2H3.1 Expressando Equine FceRIa </td><td> - </td><td> - </td><td> Produzido no laboratório </td></tr><tr><td> Equine IgE anti NIP-HSA </td><td> - </td><td> - </td><td> Produzido no laboratório </td></tr><tr><td> Placa de 96 poços </td><td> Sigma </td><td> CLS3595 </td><td> - </td></tr><tr><td> Multi Channel Pipeta </td><td> Anachem </td><td> - </td&gt; <td> - </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Galaxy R </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 4-hidroxi-5-iodo-3-nitrofenilacético ácido </td><td> Cambridge Research Bioquímicos </td><td> N-1070-1 </td><td> NIP-OH foi conjugado com albumina sérica humana para fazer NIP-HSA no laboratório </td></tr><tr><td> Dinitrofenil conjugado com Albumina de Soro Humano </td><td> Sigma </td><td> A6661 </td><td> Abreviada DNP-HSA </td></tr><tr><td> Placa espectrofotômetro </td><td> Anthos Labtec HT2 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> P1851 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloreto de Magnésio </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td&gt; <td> C1016 </td><td> - </td></tr><tr><td> Triton x100 </td><td> Sigma </td><td> X100 </td><td> - </td></tr><tr><td> 4-nitrofenilo N-acetil-β-D-glucosaminida </td><td> Sigma </td><td> N9376 </td><td> Da solução de substrato chamado β-hexosaminidase foi preparado a 50 mM em DMSO </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ácido cítrico </td><td> Sigma </td><td> 251275 </td><td> - </td></tr><tr><td> Acetato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S7670 </td><td> - </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma </td><td> T5941 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Tabela de Materiais e Equipamentos: <img alt="A Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: </strong&gt; os resultados do ensaio de lançamento: Gráfico A mostra o ensaio de liberação de pré-formados em células RBL-2H3.1 não expressam eqüinos FceRIa e que expressam o receptor usando o mouse IgE anti DNP-HSA. O rato de IgE se liga ao receptor endógeno de rato, resultando em libertação de mediador quando desafiados com o antigénio DNP-HSA, confirmando assim que ambas as linhas de células são viáveis ​​e suporta mediada por IgE induzida por antigénio a libertação de mediadores 2, 3. O gráfico B mostra o ensaio de libertação pré-formado em RBL-2H3.1 células parentais que não expressam equina FceRIa e os que expressam equina FceRIa, utilizando equina IgE anti-NIP de HSA para a sensibilização da célula. A IgE equino se liga ao receptor de equino, mas não o receptor endógeno de rato, para resultar na libertação de mediadores, isto é confirmado, uma vez que as células parentais não libertar mediadores mediador, enquanto que as células que expressam o receptor de apoio equina equina mediada por IgE, antigénio induzido , mediador release 2, 3. <img alt="A Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2: resultados do ensaio de libertação de Imunização: O gráfico mostra o ensaio de libertação de pré-formada sobre células RBL-2H3.1 expressam canino FceRIa, utilizando canino IgE anti-NIP de HSA para a sensibilização da célula, e de ratos imunizados anti-canino-IgE do soro como antigénio. O controlo foi utilizado o soro pré-imunizado, e o controlo positivo foi o antigénio NIP-HSA. O canino IgE se liga ao receptor canino. Além disso, o soro anti-IgE se liga ao receptor de IgE ligado canino e ligações cruzadas ele, e o receptor, na superfície das células, resultando na libertação de mediadores. Isto, com efeito, comprova que esta estratégia de imunização especial, tem o potencial de provocar uma reacção de choque anafilático, e é, assim, considerada não segura 30.

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Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K visualizações.  King Abdulaziz University. The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Structural Analyses of An Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Single-Chain Fragment Variable via An In Silico Approach

Single-chain fragment variable (scFv) antibodies were previously constructed of variable light and heavy chains joined by a (Gly4-Ser) 3 linker. The linker was created using molecular modeling software as a loop structure. Here, we introduce a protocol forin silico analysis of a complete scFv antibody that interacts with the epidermal growth factor receptor (EGFR). The homology modeling, with Pyrx of protein-protein docking and molecular dynamic simulation of the interacting scFv antibody and EGFR First, the authors used a protein structure modeling program and Python for homology modeling, and the antibody scFv structure was modeled for homology. The investigators downloaded Pyrx software as a platform in the docking study. The Molecular dynamic simulation was run using modeling software. Results show that when the MD simulation was subjected to energy minimization, the protein model had the lowest binding energy (-5.4 kcal/M). In addition, the MD simulation in this study showed that the docked EGFR-scFv antibody was stable for 20-75 ns when the movement of the structure increased sharply to 7.2 &#197;. In conclusion, in silicoanalysiswas performed, and the molecular docking and molecular dynamics simulations of the scFv antibody proved the effectiveness of the designed immune-therapeutic drug scFv as a specific drug therapy for EGFR.

Structural Analyses of An Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Single-Chain Fragment Variable via An In Silico Approach

This antibody homology modeling prediction protocol is followed by antibody-receptor Pyrx docking and molecular dynamic simulation. These three primary methods are used to visualize the accurate antibody-receptor binding areas and the binding stability of the final structure.

Single-chain fragment variable (scFv) antibodies were previously constructed of variable light and heavy chains joined by a (Gly4-Ser) 3 linker. The ...

Genética

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of this research model are the ease of breeding and sample collection, relatively short gestation period, and large litter sizes. Commonly assessed routes of immunization include subcutaneous, intramuscular, intranasal, and intradermal. Nonterminal sample collection for the chronological detection of the immunologic responses to these immunizations include the collection of blood, from both dams and kits, and milk from the lactating does. In this article, we will demonstrate techniques our lab has utilized in studies of maternal immunization in New Zealand White rabbits (Oryctolagus cuniculus), including intranasal immunization and milk collection.

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

This article describes and demonstrates the administration of intranasal vaccines and the collection of milk from lactating rabbits (Oryctolagus cuniculus) as a means to assess mucosal immunity in a translationally appropriate model of maternal immunization.

Imunização Intranasal e Coleta de Leite em Estudos de Imunização Materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...

Estabelecimento de uma Monocamada 2D a partir de Cultura Enteróide Ileal Bovina 3D

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Autor em destaque: Modelo enteróide avançado para estudar interações hospedeiro-patógeno 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

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