Name: detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde 26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins. 1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação <ol><li> Sacrifique um rato neonatal por inalação de CO2. </li><li> Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato. </li><li> Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml. </li><li> Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação. <ol><li> Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio. </li></ol></li><li> Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose. <ol><li> Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração. </li></ol></li></ol> 2. Inclusão do Tecido <ol><li> Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média. </li><li> Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde. <ol><li> Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro. </li></ol></li><li> Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito. </li><li> Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. </li><li> Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado. </li><li> Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses. </li></ol> 3. cryosectioning incorporado Limbs <ol><li> Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário. </li><li> Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte. </li><li> Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato. </li><li> Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço. <ol><li> Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação) <ol><li> Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana. </li><li> Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível. </li><li> Seções permeabilizar <ol><li> Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS. </li><li> Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa. </li><li> Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide. </li><li> Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar. </li><li> Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados. </li><li> Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível. </li></ol></li><li> Rotulagem pausa DNA TdT mediada <ol><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso. </li><li> Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado &quot;nuclease&quot; no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação. </li><li> Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al<html> ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin. </li><li> Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível. </li></ol></li><li> Marcação fluorescente <ol><li> Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min. </li><li> Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide. </li><li> Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min em PBS. </li><li> Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Aquisição de Imagem Digital <ol><li> Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo. </li><li> Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa. <ol><li> Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático. </li><li> Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade. </li></ol></li><li> Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser &quot;costurado&quot; juntos. </li></ol> Análise 6. Imagem <ol><li> Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL. </li><li> Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H &amp; E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H &amp; E em combinação com um atlas de anatomia 5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados. </li><li> Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado). </li><li> Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência. </li><li> Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras. </li><li> Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado. </li><li> Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computador para análise de imagens. O pesquisador deve estar ciente dos perigos potenciais. Autofluorescência do tecido é uma grande preocupação em imagens de fluorescência. Em animais não perfundidada, mantendo-se os glóbulos vermelhos contribuirá sinal bastante elevado autofluorescent. As células endoteliais também podem ser significativamente autofluorescente. Portanto, é importante para confirmar que a autofluorescência não é confundido com o sinal de TUNEL positivo. Esta avaliação é realizada facilmente, tendo uma imagem em um canal sem fluorophore, a ser utilizado para comparação e possível subtracção do canal de TUNEL positivo. Desta forma, o método de TÚNEL à base de fluorescência é superior aos métodos de microscopia de campo claro colorimétricos que não proporcionem um controlo interno para a coloração de fundo. Fixação do tecido terá um impacto significativo no sucesso da rotulagem TUNEL. É melhor para minimizar o tempo de fixação em paraformaldeído, para não exceder 24 horas. Tecido embrionário e neonatal, serão necessários tempos de fixação significativamente menores do que 24 horas. Quando marcação TUNEL é bem sucedido, o sinal de TUNEL positivo deve ser muito maior do que o fundo da autofluorescência, de modo que o sinal pode ser facilmente isolado por intensidade de limiar de propagação usando software de análise de imagem. Recuperação de antigénios utilizando o protocolo padrão de aquecimento em tampão citrato 27,35 pode melhorar ligeiramente sinal de baixa TUNEL se o tempo de aquecimento é mantido a um mínimo (5 min), mas este pré-tratamento de dezds para reduzir o sinal de TUNEL, se o aquecimento for prolongado por períodos mais longos (por exemplo, 20 minutos a 95 ° C). Recuperação antigênica aumentará autofluorescência de fundo e falsos positivos, e, portanto, pode anular quaisquer ganhos na relação sinal-ruído de sinal aumentado TUNEL. As medições de sinal TUNEL deve ser normalizada quer para a área total do músculo ou quantificada com o número de núcleos por área quantificada. Porque TUNEL mede núcleos apoptóticos, a normalização ideal seria núcleos totais. No entanto, mesmo em 10 (um) seções musculares relativamente finas, as fibras musculares e núcleos são tão numerosas e embalado tão de perto, que é impossível contar automaticamente núcleos Hoechst-manchadas por thresholding e de separação de partículas algoritmos. Contagem manual também é muito trabalhoso e impreciso. A alternativa viável é a normalizar a área total do músculo. O ensaio de TUNEL, utilizado com o processamento do tecido apropriadotécnicas e os controlos positivos e negativos, é um método relativamente rápido, reprodutível, quantitativo para a detecção de danos no ADN e morte celular em tecidos. Ele pode ser usado para confirmar a apoptose como um mecanismo patológico, para identificar os tipos de células afectadas, e para avaliar a eficácia dos tratamentos terapêuticos. Este procedimento será de valor para pesquisadores nas áreas de doença do músculo esquelético e lesões, incluindo SMA, ALS, distrofia muscular, miopatia induzida pela toxina, e fisiologia do exercício.

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 &#39;da dupla e ADN de cadeia simples quebra 12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido 7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios 6,14,29 e cardiomiócitos 43,44, morte celular neuronal excitotóxica 30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite 39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras 7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células 4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético 8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples 25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) 13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica 34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite. Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) 10 que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas 16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal 10. Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária. Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (ADNase adicionada) deve apresentar o sinal de TUNEL positivo abundante, distribuído uniformemente em todos os tecidos na secção (Figura 1C). O controle negativo (enzima TdT omitido da reação) deve render fundo de baixa intensidade e sinal autofluorescent apenas (Figura 1D). Pele, proporciona um controlo positivo interno em secções de perna inteiros, como esse tecido tem uma alta taxa de apoptose normal (Figura 1A). Sangue vermelhocélulas do osso, células endoteliais, e pode contribuir sinal autofluorescente significativa (Figura 2). Aconselha-se a imagem de cada seção em um canal separado sem marcação fluorescente para garantir que autofluorescência não é confundido com sinalização TUNEL positivo. Sinal de TUNEL positivo verdadeiro deve ter muito maior intensidade do que a autofluorescência, de modo que possa ser isolado por meio de estabelecimento de limiares de intensidade de imagem (Figura 2A, linha média). Alternativamente, o canal pode ser autofluorescente digitalmente subtraído do canal de TUNEL para produzir o sinal de TUNEL positivo (Figura 2A, linha inferior). O método de marcação TUNEL aqui descrito foi usado para quantificar a morte de células do músculo esquelético, em um modelo de rato de SMA 10. Rotulagem TUNEL mostra um aumento no número de perfis apoptóticos em músculos da perna, de 5 dias de idade os ratos SMA, em comparação com controlos da mesma ninhada (Figura 3A). O aumento em apoptose équantificável pelo método descrito acima, indicando diferenças estatisticamente significativas em vários grupos musculares (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: rotulagem TUNEL Representante dos músculos dos membros posteriores do mouse. (A) TUNEL marcado secção transversal do membro posterior do rato mostrando músculo tibial anterior, tíbia, e pele. TA - tibial anterior, Fdl - flexor longo dos dedos, Edl - extensor longo dos dedos. Green - TUNEL, azuis - núcleos, vermelho - sinal autofluorescent. As linhas pontilhadas delinear áreas musculares para quantificação. Pele adjacente músculos dos membros posteriores fornece um controle interno positivo para a rotulagem TUNEL. Barra de escala = 200 mm. (B) representativos imagens de alta ampliação identificando TUNEL-positivo estruturas (verde) em embrionário<html> dia 13 de rato músculo esquelético como núcleos apoptóticos. Escala da barra = 10 m. A e B modificada a partir Fayzullina e Martin 2014 10. (C) de secção transversal do membro posterior do rato TUNEL marcado após o tratamento de DNase para servir como um controlo positivo. A maioria dos núcleos têm rotulagem TUNEL brilhante. Escala da barra = 50 m. (D) Secção transversal do mesmo membro posterior do rato como se mostra em C (semi-adjacente a secção em C) TUNEL marcado com enzima TdT omitido para servir como um controlo negativo. Não há sinal de TUNEL-positivo brilhante; o único sinal verde é autofluorescência como detectado por co-localização com sinal no canal vermelho. Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2 &quot;fo: content-width =&quot; &quot;src =&quot; 6 pol / files / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 2: A autofluorescência do tecido deve ser considerado e excluídos da quantificação na análise de rotulagem TUNEL. (A) seção transversal hindlimb Rato com rotulagem TUNEL e autofluorescência: imagem original (topo de linha), a mesma imagem com os limites ajustados (linha do meio), e mesma imagem com autofluorescência canal (vermelho) subtraído (linha de fundo). Thresholding elimina celular mais vermelha do sangue e autofluorescência de células endoteliais, mas não o artefato coloração (ponta de seta, linha do meio). Subtração Canal também elimina o artefato coloração (ponta de seta, linha inferior). Green - TUNEL, vermelho - autofluorescência, azuis - núcleos. Barra de escala = 100 pm. Imagem Maior ampliação do painel autofluorescência vermelho retângulo cinza delineia área ampliada em B. (B) em A. Glóbulos vermelhos e algumas células endoteliais (setas), e uma TISSue coloração artefato (seta) autofluoresce em ambos os filtros de fluorescência vermelha e verde. Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: rotulagem TUNEL mostra a morte de células no músculo esquelético de ratos SMA neonatais músculos da parte inferior dos membros posteriores de ratos SMA em dia pós-natal 5 foram marcadas pelo método TUNEL (A) rotulagem TUNEL mostra vários perfis apoptóticos em vários grupos musculares em SMA mouse.. músculo (direito) em comparação com o controlo da mesma ninhada (esquerda). Green - TUNEL, azul - Hoechst (núcleos), vermelho - autofluorescência. As linhas pontilhadas delinear as áreas musculares quantificados. TA - tibial anterior, Fdl - dig flexoritorum longus, Edl - extensor longo dos dedos. Barras de escala = 200 pm rotulagem. (B) TUNEL foi quantificada como a área total de pixels de sinal de TUNEL normalizada para a área total de pixels de músculo. Médias ± erros padrão são ilustrados, n = 4 - 5 ratinhos. A significância estatística entre SMA e de controlo para cada grupo muscular (unicaudal t-teste): * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Este valor foi modificado a partir Fayzullina e Martin 2014 10. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K visualizações.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Vídeo: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Bioengenharia

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Biologia do Desenvolvimento

Identificando danos ao DNA em oócitos de camundongos com prisão de prófase

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor em destaque: Compreendendo a resposta a danos no DNA em oócitos de mamíferos e embriões pré-implantação 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Biologia

Traçando o perfil de marcas de histonas genômicas em mioblastos de camundongos usando CUT&#38;Tag

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Autor em destaque: Navegando pelos desafios e inovações nos estudos com células-tronco musculares

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&#38;Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético

Resumo

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Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas