Name: detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 절차가 건강 (26)의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 프로토콜 (MO13M391)는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 신생아 마우스 희생, 해부 및 고정 <ol><li> CO 2 흡입 신생아 마우스를 희생. </li><li> 바로 무릎 위의 사지를 잘라. 약 출생 후 7 일까지, 다리 뼈는 저온 유지 장치에 연속적으로 섹션에 큰 실험실 가위 날카로운 칼날을 극복 할만큼 부드럽고합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS)에 차가운 얼음 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖의 뒷다리를 놓습니다. </li><li> 집중은 4 ℃에서 4-24 시간 동안 파라 포름 알데히드의 사지를 고정합니다. 배아 조직은 여러 시간이 필요합니다고정의의. <ol><li> 이 TUNEL 분석 효율을 감소시킬 수 있으므로 24 시간보다 더 오래 고정을하지 마십시오. </li></ol></li><li> 자당 용액에 침지하여 뒷다리를 Cryoprotect. <ol><li> 같은 15 ML 튜브에 PBS의 10 % 자당에 파라 포름 알데히드를 변경, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li><li> PBS 30 % 수크로오스로 변경, 4 ° C에서 또는 튜브의 바닥 뒷다리 싱크까지 밤새 배양한다. 조직을 수크로오스 멸균 여과되었음을 제공, 긴 기간 동안 30 % 수크로오스에 남아있을 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 포함] <ol><li> 매체를 포함와 레이블이 포함 금형 절반 방법을 채 웁니다. </li><li> 몰드의 한쪽 벽에 최대한 가깝게 잘라면이 매립 매체 위에 배치 뒷다리. 금형의 외부에 뒷다리의 방향을 표시합니다. <ol><li> 여러 뒷다리를 포함하고 같은 블록으로 잘라. 그러나, 모든 힌을 확인하는 것이 중요하다블록 dlimbs은 사지의 축 방향과 일치하는 수준에서 섹션을 얻기 위해 서로에 대해 평행하게 배향된다. </li></ol></li><li> 매체를 포함와 뒷다리를 커버. 매체를 붓는 동안 뒷다리가 이동하는 경우, 무딘 팁 집게 또는 이쑤시개로 다시 방향. </li><li> 적어도 15 분 동안 실온에서 조직에 침투되는 매립 매체 허용. </li><li> 직접 드라이 아이스 또는 드라이 아이스에 이소 펜탄에 넣어 금형은 매체를 포함 동결. 항상 금형 수준을 유지하고 내장 조직의 이동을 방지해야합니다. </li><li> 몇 달까지 들어 잘라 준비까지 -80 ℃에서 냉동 금형을 보관하십시오. </li></ol> 3. 냉동 절편 임베디드 사지 <ol><li> -20 ° C로 설정 저온 유지 챔버 온도, -18 ° C에서 객체 온도; 필요에 따라 개체를 아래로 온도를 조절합니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 저온 유지 챔버 내부 조직 블록을 평형. 올바른 블록 온도erature 섹션의 품질에 대한 중요합니다. </li><li> 10 ㎛ 이하의 두께로 잘라 횡단면도. 두꺼운 섹션은 완전히 TUNEL 시약에 의해 침투되지 않습니다. 안티 - 롤 플레이트, 블레이드, 블레이드 각도를 사용하여 (일반적으로 5 °)는 저온 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 실온에서 젤라틴 또는 vectabond 코팅 된 유리 슬라이드 위에 섹션을 수집합니다. 드라이 아이스에서 슬라이드 상자에 바로 놓습니다. 팔의 손이 닿는 곳에 저온 유지 장치 부근에 드라이 아이스와 별도의 용기에 슬라이드 상자를 보관하십시오. <ol><li> 100 ~ 200 μm의 생략, 사지의 장축을 통해 가로 시리얼 부분을 잘라. 각 시리얼 수준에서 최소 3 인접한 섹션을 수집합니다. </li></ol></li></ol> 상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 뒷다리 섹션 4. TUNEL 분석 (실온에서 모든 단계를 언급하지 않는) <ol><li> 실내 온도와 건조 야간 또는 주말 섹션이 슬라이드를 해동. </li><li> immersin로 섹션을 재수코 플린 항아리에 2 × 10 분 동안 PBS에서 g 슬라이드. 실험실 건조 가능한 부분 주위에 많은 액체를 제거 닦아냅니다. </li><li> Permeabilize 하시려면 섹션 <ol><li> 비 단백질 분해, 사포닌 기반 상용 시약 0.5 % 트윈 20 0.05 % PBS에 트리톤 X100를 사용합니다. </li><li> 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 충분한 물이 상자의 바닥을 추가로 포함하도록 간단한 습도 챔버는 뚜껑이 꽉 빈 피펫 팁 상자이다. </li><li> 섹션을 충당하기 위해 슬라이드에 피펫 충분한 시약 (50 μl의 신생아 마우스 사지에 충분하다). 반복 교반 슬라이드를 떠 섹션의 원인이 될 수 섹션에 직접 피펫하지 마십시오. </li><li> 무딘 팁 집게 사용 시약의 드롭을 확산 섹션의 상단에 파라 필름의 작은 사각형을 배치하고 완전히 섹션 커버. 모든 거품이 파라 필름에서 형성되면, 부드럽게 건조, 들어 올릴 및 다시 적용합니다. </li><li> permeabili와 슬라이드를 품어덮여 습도 챔버에서 1 시간 동안 아네트 시약. 섹션 슬라이드에서 떠 시작하면, 투과성으로 시간은 30 분으로 감소 할 수있다. </li><li> 코 플린 항아리 2 × 5 분에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 파라 필름 사각형 상단에 떠 있어야하고 제거 및 폐기 될 수있다. </li><li> 실험실을 사용하면, 가능한 한 섹션 주위에 많은 액체를 닦아 건조. </li></ol></li><li> TdT에 매개 DNA 휴식 라벨링 <ol><li> (50 μL 신생아 마우스 사지에 충분하다) 조직 부분을 충당하기 위해 슬라이드에 1 배 가열 치사 라벨 버퍼, 피펫 충분히 라벨 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 또한, 코 플린 항아리에 가열 치사 라벨 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> 가열 치사 라벨 믹스를 만들기 위해 키트 지침을 따르십시오. 키트는 코발트, 마그네슘, 망간 및 양이온을 포함한다; 망간 양이온은 골격 근육, 신경계, 담배 마는 포함, 다양한 조직에 잘 작동합니다UE들, 간, 피부, 뼈. </li><li> 양성 대조군의 경우, 가열 치사 라벨 믹스의 DNase (키트에 표시된 &quot;클레아 제&quot;)를 추가합니다. 대안 적으로, 키트 설명서에 따라, 37 ° C에서 1 시간 동안 클레아 버퍼와 DNase를 포지티브 제어부 미리 치료. 교차 오염을 방지하기 위해 멀리 다른 실험 섹션에서 DNase의 솔루션과 DNase를 처리 섹션을 유지합니다. </li><li> 음성 대조군의 경우, 라벨 믹스에서 가열 치사 효소를 생략합니다. </li><li> 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 가열 치사 라벨 버퍼를 제거 와이프 ​​사용합니다. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 가열 치사 라벨 믹스, 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 1 시간 동안 37 ° C에서 습도 챔버에 품어. </li><li> 1X 정지 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 슬라이드에서 가열 치사 라벨링 믹스를 닦아 제거하는 랩을 사용하여 조직 절편을 커버하도록 200-300 μL 정지 완충액을 추가 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 알<html> 대체적으로, 코 플린 항아리에 정지 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> PBS에서 슬라이드 2 × 2 분을 씻으십시오. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li></ol></li><li> 형광 라벨 <ol><li> DNA 나누기에 dNTPs를 레이블을 형광 라벨 용액을 제조 키트 지침을 따르십시오. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 솔루션은 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 20 분 동안 습도 챔버에 품어. </li><li> 코 플린 항아리에 PBS에서 2 분 동안 세척 슬라이드. 연구소는 슬라이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li><li> 슬라이드에 1 μg의의 /의 PBS에서 ml의 피펫에 훽스트 33258 핵 얼룩을 희석 (100 ~ 200 μl의 부분을 커버하기에 충분하다). 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. </li><li> PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오. </li><li> antifade 형광 장착 미디어 커버 슬립과 매니큐어와 가장자리를 밀봉. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. 디지털 화상 취득 <ol><li> DAPI, FITC, 텍사스 레드 필터 (또는 동급)와 기존의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 라벨이 성공과 핵 (손상 또는 조각)가 표시되었는지 확인하기 위해 높은 배율의 목표 (20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 10X 목적은 TUNEL 양성 puncta의 정량에 충분하다. </li><li> 하나의 이미지로 결합 별도의 세 가지 거짓 컬러 채널로 훽스트 염색, TUNEL 염색 및 autofluorescent 신호의 이미지를 수집합니다. TUNEL의 형광 라벨과 적색 필터, 이미지 autofluorescent 신호, 녹색이면 그 반대로. <ol><li> 이후 임계 값 및 정량 슬라이드 사이에 해당하는 모든 이미지 설정을 유지합니다. 각 필터, 사전 설정 및 녹화 노출 시간, 게인 및 비닝 (binning)을 위해 (더 비닝 (binning)는 최고의 없음); 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오. </li><li> 가장 INTEN의 범위를 캡처 노출 및 게인 설정을 찾기 위해 시행 착오를 사용하여모든 스테인드 슬라이드에 걸쳐 잇고. 획득 된 이미지에는 포화 픽셀이 의지 바이어스 정량으로,이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 관심의 전체 근육 그룹의 이미지를 가져 가라. 이것은 함께 &quot;스티치&quot;할 여러 이미지를 필요로 할 수있다. </li></ol> 6. 이미지 분석 <ol><li> TUNEL 염색의 디지털 이미지를 분석하는 상용 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 분석 여기에 표시됩니다. 대안 적으로, NIH로부터 자유 소프트웨어가 ImageJ에 TUNEL 염색을 분석하는데 사용될 수있다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 TUNEL 염색 섹션에 인접한 섹션을 얼룩과 기존의 시야 현미경으로 전체 섹션 디지털 이미지를 촬영합니다. 정량화 할 수있는 해부학 적 구조를 추적 해부학 아틀라스 5,18,19와 조합이 H &amp; E 이미지를 사용합니다. </li><li> TUNEL 채널을 끈 상태에서 수동으로 사용하여 정량 영역의 윤곽을 추적훽스트 (Hoechst)와 안내자가 형광 채널. 마스크로 추적 영역 변환 (선택한 화소의 세트를 분석 할 좌표). </li><li> TUNEL 채널을 켭니다. 이미지 분석 프로그램 기능을 임계 화 강도를 사용하여, 모든 자기 형광 신호를 제외하는 임계 값을 낮게 설정한다. </li><li> 연구 세트의 모든 이미지에 동일한 임계 값 설정을 적용합니다. 마스크로 역치 선택을 변환합니다. </li><li> 예를 들어, 각각의 이미지가 근육 영역 마스크와 마스크 TUNEL을 결합한다. 새로운 조합 마스크는 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호를 나타냅니다. </li><li> 객체의 수를 확인하고 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호의 영역을 객체로 조합 마스크에 마스크 정량을 수행합니다. ImageJ에있는 입자 분석기 기능을 사용하여이 작업을 수행합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

방법은 감지하고 정량적으로 설명 마우스 골격 근육에서 DNA 손상 관련 세포 사멸을 분석합니다. 절차는 조직 수확, TUNEL 염색, 디지털 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함한다. 일반적인 조직 학적 용품 및 도구가 필요하고, 특수 TUNEL 상업용 키트가 필요하다. 필요한 필수적인 큰 장비 항목은 저온 유지 장치, 디지털 영상 능력 epifluorescent 현미경 및 이미지 분석을위한 컴퓨터 시스템이다. 실험은 잠재적 인 함정을 알고 있어야합니다. 조직자가 형광은 형광 이미징의 주요 관심사입니다. unperfused 동물, 적혈구 남은 상당히 높은 autofluorescent 신호를 기여할 것이다. 내피 세포도 크게 autofluorescent 할 수있다. 따라서, 그자가 형광을 확인하는 것이 중요하다 TUNEL 양성 신호로 오인하지 않습니다. 이 평가는 쉽게 아니 FL 채널로 화상을 취함으로써 달성된다uorophore, TUNEL 양성 채널에서 비교 가능한 빼기에 사용되는. 이와 같이, 형광 기반 TUNEL 방법은 배경 염색 내부 제어를 제공하지 않는 색채 시야 현미경 법보다 우수하다. 조직의 고정은 TUNEL 라벨의 성공에 중요한 영향을 미칠 것이다. 그것은, 파라 포름 알데히드에 고정 시간을 최소화하기 위해 24 시간을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 배아 및 신생아 조직은 24 시간보다 훨씬 짧은 고정 시간을 필요로 할 것이다. TUNEL 라벨링이 성공하면 그 신호가 용이하게 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 강도 임계 게이팅에 의해 분리 될 수 있도록, TUNEL 양성 신호는 배경 형광도보다 훨씬 더 높아야한다. 시트르산 완충액 27,35 가열의 표준 프로토콜을 사용하여 항원 검색 약간 가열 시간이 최소값 (5 분)으로 유지된다 TUNEL 저 IF 신호를 개선하지만,이 전처리 수 십가열 (95 ° C에서 예를 들면 20 분) 이상 기간을 연장하면 DS는 TUNEL 신호를 줄일 수 있습니다. 항원 회수가 증가 TUNEL 신호로부터 신호 대 잡음 비의 모든 이득을 깨뜨릴 수있다, 따라서 자기 형광 배경과 위양성을 증가 할 것이다. TUNEL 신호 측정 정량 근육 전체 영역 또는 정량 면적당 핵의 개수 중 ​​정규화되어야한다. TUNEL은 세포 사멸 핵을 측정하기 때문에, 이상적인 정상화 전체 핵이 될 것이다. 그러나, 상대적으로 얇은 (10 μm의) 근육 섹션에서, 근섬유와 핵 너무 많다 및 자동 임계 값 및 입자 분리 알고리즘에 의해 훽스트 염색 핵을 계산 불가능하다, 너무 밀접하게 포장. 수동 계산도 매우 노동 집약적이고 부정확하다. 가능한 대안은 전체 근육 영역에 정규화한다. 적절한 조직 처리에 사용 TUNEL 분석,기술 및 양성 및 음성 대조군 조직에서 DNA 손상과 세포 사멸을 검출하기위한 비교적 빠르고, 재현 가능한 정량 방법이다. 이것은 영향을받은 세포 유형을 확인하고, 치료 학적 치료의 효능을 평가하기 위해, 병적기구로서 아폽토시스를 확인하는데 사용될 수있다. 이 절차는 SMA, ALS, 근육 영양 장애, 독소에 의한 근육 병증을 포함한 골격 근육 질환과 부상 등의 분야에서 연구에 가치가, 생리학을 행사합니다.

터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 TDT () 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL)이 dUTP를 3를 연결합니다 가열 치사 효소를 사용하는 과정은 &#39;단일 및 이중 가닥 DNA가 12, 23 나누기 끝입니다. 세포 사멸 및 DNA 손상의 검출을위한 TUNEL 방법은 첫째 Gavrieli 등. 1,12,24 20 년 전에보고되었다. 그것은 이후 평가와 다른 조직 준비 7,23,27,40에 최적화되었습니다. TUNEL 뉴런 6,14,29 및 43, 44 심근 허혈에 의한 세포 죽음, 흥분성 신경 세포 사멸 (30, 31)을 연구하는 데 사용하고, 관절염 치료 (39)의 바이오 마커로하고있다. 또한, 다양한 인간 암에서 2,3,15,32,37,38,42 예후 인자 및 종양 세포 마커로 사용되었다. 다른 방법은 DNA 손상 및 세포 사멸 검출을 위해 존재하지만, 그들은 기술적 인 문제와주의 사항이 있습니다. 서던 블랏 quantif하는데 사용될 수있다Y DNA 전체 조직 해물 7,9-11 손상,하지만이 방법은 세포 수준의 해상도를 제공하고 정량화하기 어려운되지 않습니다. 혜성 분석은 세포 4,20,28,36에서 보존 핵을 추출 필요로하는 다른 셀 기반 방법입니다. 혜성 분석법 격리 배양 세포에서 잘 작동하지만, 골격근 조직 8,21에서 그대로 핵을 제조하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 서던 블랏과 마찬가지로 혜성 분석은 전체의 근육 조직 파쇄 액으로부터 세포 유형 특정 정보를 제공하지 않는다. TUNEL 방법에 대한 또 다른 대안은 단일 가닥 DNA 25,33,41에 대해 또는 DNA 손상 반응과 세포 사멸 경로에 (예를 들어 p53을, H2AX, 그리고 카스파) 13,17,22,40 참여 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학이다. 이러한 항체 - 기반 방법은 높은 신호 대 백그라운드 비율을 수득 항체의 철저한 특성이 우수한 항체 특이성을 필요로한다. 경우에도 사양IFIC 항체들은 항원 검색 절차 (34, 35)을 통해 목적 단백질의 변성을 요구할 수있는. 우리가 여기에서 토론 할 때, 허용 할 수 없을 정도로 높은자가 형광의 근육 조직 결과에 항원 검색. 다른 방법과 달리, TUNEL 간단 양성 및 음성 대조군, 우수한 조직 침투 항원 검색을 필요로하지 않으며, 세포 수준의 해상도로 테스트 될 수있는 높은 신호, 낮은 백그라운드, 우수한 특이성 DNA 손상 검출을 달성한다. 다른 방법은 전형적으로 밤새 항온 처리를 요구하는 반면, 또한, TUNEL 방법은 완료하는 데 약 4 시간이 걸린다. 우리는 리튬 - Hsieh의 동료 (16)에 의해 생성 된 척수 근위축증 (SMA) (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 사멸 연구. 근육 세포 사멸을 정량화하기 위해, 우리는 다른 skele 걸쳐 견고 작동 티슈 제조, 염색 및 정량하는 방법을 개발했다마우스에서 발달 상이한 시점에서 탈 근육 그룹. 우리는 시중에서 판매하는 TUNEL 라벨링 키트 및 상용 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 척수 (10)에 면역 형광 염색법과 함께 TUNEL 분석을 사용했다. 여기에 설명 된 방법은 골격 근육에서 조직 병리, 질병의 메커니즘, 노화의 메커니즘과 발달 (사전 및 산후) 세포 사멸을 평가하려는 연구자 유용합니다. TUNEL 기술은 세포의 서브 세트 만이 영향을 세포 수준의 해상도가 필요하다 모델 시스템에서의 DNA 손상과 수리 및 세포 사멸 연구에 특히 유용하다. 이 동영상은 해부, 조직 처리, 절편, 마우스 골격 근육의 형광 기반의 TUNEL 라벨을 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

성공적인 조직 화학 염색, TUNEL 양성 신호 강도 임계치를 설정하여자가 형광 물질로부터 격리 할만큼 밝은해야한다. 낮은 배율에서 TUNEL 양성 개체는 골격 근육 (그림 1A)에 밝은 불규칙한 조각을 나타날 수 있습니다. 관련된 세포 사멸 유형은 세포 사멸 (도 1b) 인 경우에는 고배율, 고전 사멸 형태 일부 TUNEL 양성 개체 관찰되어야한다. 양성 대조군 (DNase를 추가) 섹션 (그림 1C)의 모든 조직에 걸쳐 균일하게 분포 풍부한 TUNEL 양성 신호를 전시한다. 음성 대조군 (반응 생략 가열 치사 효소) 낮은 강도의 배경 및 autofluorescent 신호 만 (그림 1D)를 산출한다. 이 조직은 정상 세포 사멸 (그림 1A)의 높은 속도를 가지고 같은 피부, 다리 전체 섹션의 내부 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다. 적혈구세포, 뼈, 내피 세포는 상당한 autofluorescent 신호 (그림 2) 기여할 수있다. 그것은 그자가 형광을 보장하기 위해 더 형광 라벨에 별도의 채널의 각 섹션은 긍정적 인 TUNEL 신호로 오인하지 이미지 것이 좋습니다. 그것이 이미지 세기 임계 값 (도 2A, 중간 행)를 설정하여 단리 할 수 있도록 진정한 TUNEL 양성 신호는 자기 형광보다 훨씬 높은 강도를 가져야한다. 대안 적으로, autofluorescent 채널 디지털 TUNEL 양성 신호 (도 2A, 아랫 줄)을 수득 TUNEL 채널로부터 감산 될 수있다. 여기에 설명 TUNEL 라벨링 방법 SMA (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 죽음을 정량화하는 데 사용되어왔다. TUNEL 라벨링 한배 새끼 컨트롤 (도 3A)와 비교하여, 오래된 오일 SMA 생쥐에서 다리 근육 세포 사멸 프로파일의 증가를 나타낸다. 아폽토시스의 증가는상기 방법에 의해 정량 여러 근육 군 (도 3B)에서 통계적으로 유의 한 차이를 나타내는, 상술. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1 : 마우스 뒷다리 근육의 대표 TUNEL 라벨. (A) 전 경골근 근육, 경골, 피부를 보여주는 마우스 뒷다리의 횡단면을 TUNEL는 표지. TA - 전 경골근, FDL - 굴곡 심지 longus, EDL - 신전 심지 longus. 녹색 - TUNEL, 블루 - 핵, 빨간색 - autofluorescent 신호. 점선은 정량을위한 근육의 영역을 묘사. 뒷다리 근육에 인접한 피부 TUNEL 라벨링에 대한 내부 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다. 스케일 바 = 200 μm의. (B) 대표 고배율 이미지 배아에서 TUNEL 양성 구조 (녹색) 식별<html> 세포 사멸 핵으로 하루 13 마우스 골격 근육. Fayzullina 마틴 2014 10에서 수정 된 스케일 바 = 10 μm의. A와 B는. 마우스 뒷다리의 (C) 가로 섹션 양성 대조군으로 제공하기 위해 DNase를 처리 후 TUNEL 표지. 대부분의 핵 밝은 TUNEL 라벨이 있습니다. 스케일 바 = 50㎛의. (D)에 도시 된 바와 같이 C와 동일한 마우스 뒷다리 횡단면 (C 섹션에 인접한 반 -) 대조군 역할을 생략 가열 치사 TUNEL 효소 - 표지. 더 밝은 TUNEL 양성 신호가 없습니다; 빨강 채널에서 신호 colocalization을 인식 한 유일한 녹색 신호는 형광도있다. 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2 &quot;FO : 콘텐츠 폭 =&quot;6 인치 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg &quot;폭 =&quot;600 &quot;/&gt; 그림 2 : 조직의 형광도 고려하고 TUNEL 라벨을 분석 할 때 정량 분석에서 제외해야합니다. TUNEL 라벨링 및자가 형광과 (A) 마우스 뒷다리의 횡단면 :자가 형광 (적색) 채널 원본 이미지 (맨 윗줄), 조정 된 임계 값과 동일한 이미지 (가운데 줄)과 같은 이미지는 (아랫 줄)을 차감. 임계 대부분의 적혈구 세포와 내피 세포의 형광도 있지만 염색 이슈 (화살촉, 중간 행)을 제거한다. 채널 빼기도 염색 이슈 (화살촉, 맨 아래 줄)을 제거한다. 녹색 - TUNEL, 빨간색 -자가 형광, 블루 - 핵. 스케일 바 = 100 μm의. 회색 사각형은 B에서 확대 된 영역을 묘사한다. (B) 빨간색 형광도 패널의 높은 배율 이미지에서. 적혈구 일부 내피 세포 (화살표) 및 마는모두 빨간색과 녹색 형광 필터에서 UE 염색 이슈 (화살촉) autofluoresce. 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3 : TUNEL 라벨 신생아 SMA 마우스의 골격 근육에서 세포 사멸을 보여줍니다 출생 후 5 일에서 SMA 마우스에서 낮은 뒷다리 근육이 TUNEL 방법으로 표시 한 (A) TUNEL 라벨은 SMA 마우스의 여러 근육 그룹의 여러 세포 사멸 프로파일을 보여줍니다.. 한배 새끼 제어 (좌측)과 비교하여 근육 (오른쪽). 녹색 - TUNEL, 블루 - 훽스트 (핵), 빨간색 - 형광도. 점선은 정량 근육 영역을 묘사. TA - 전 경골근, FDL - 굴곡 발굴itorum의 longus, EDL - 신전 심지 longus. 스케일 바는 = ~ 200㎛. (B) TUNEL 라벨링 근육의 전체 화소 영역에 규격화 TUNEL 신호의 전체 화소 영역으로서 정량 하였다. 5 마우스 - 수단 ± 표준 오차는 4 표시, N =됩니다. 각 근육 그룹 (한 꼬리 t-Test)에서 SMA 및 제어 사이의 통계적 유의성 : * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. 이 그림은 Fayzullina 마틴 2014 10에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K 조회수.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

비디오: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

연구

발생학

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

근육 질환의 구조적 기초를 연구하기위한 도구로 그대로 뮤린 골격 근육의 X 선 회절

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

마우스의 Prophase-Arrested 난모세포에서 DNA 손상 확인

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

저자 스포트라이트: 포유류 난모세포와 착상 전 배아의 DNA 손상 반응 이해 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

생물학

CUT&#38;Tag를 사용한 마우스 근아세포의 게놈 히스톤 마크 프로파일링

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

저자 스포트라이트: Navigating Challenges and Innovations in Muscle Stem Cell Studies(근육 줄기 세포 연구의 과제와 혁신 탐색)

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&#38;Tagmentation) 분석 사용

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

근육 손상 위험이 감소한 마우스에서 복용량 조정 저항 훈련

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석

요약

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이 비디오의 챕터

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

근육 질환의 구조적 기초를 연구하기위한 도구로 그대로 뮤린 골격 근육의 X 선 회절

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

근육 손상 위험이 감소한 마우스에서 복용량 조정 저항 훈련