Name: preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

O protocolo a seguir está de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidado Animal e foi aprovado pela Faculdade de Medicina e do Comitê Animal Care Farmácia da Universidade de Toronto. 1 Prepare Obrigatório Reagentes conforme descrito na Tabela 1 <ol><li> Adicionar protease e da fosfatase (se necessário) os inibidores a todas as soluções de sacarose, tampões e ddH2O para concentrações descritas na Tabela 1. Importante: executar todos os passos a 4 ° C e pré-fresco todos os reagentes e equipamentos antes do início da experiência. Rotular todos os tubos, incluindo tubos de ultracentrífuga, com marcador permanente. </li></ol> 2 Dissecção da região do cérebro adequada <ol><li> Sacrificar o animal por deslocamento cervical ou decapitação. Casa e eutanásia de animais de acordo com as políticas institucionais e governamentais sobre cuidados com os animais. </li><li> Rapidamente remover ªe cérebro do crânio e colocar em um bloco de dissecção gelada. </li><li> Dissecar a região do cérebro apropriado de tecido fresco e vá para a Etapa 3. </li></ol> 3. Tissue homogeneização com Motor Impulsionada Glass-Teflon Homogeneizador <ol><li> Coloque 50-100 mg (de SPM), ou 100-200 mg (por PSD) do tecido dissecado em um tubo de polipropileno de 13 ml rotulados, contendo 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. Transfira a amostra para 15 ml de um tecido de vidro cónico-moinho Teflon / homogeneizador, definir o accionamento do motor para 900 rpm (posição 7) e homogeneizar a amostra com 12 pancadas ao longo de um período de 30 seg. Use um homogeneizador de vidro-Teflon diferente entre as amostras, ou lavar o homogeneizador com água fria destilada entre amostras e seque com um Kimwipe. NOTA: até 4 g de tecido podem ser homogeneizados em 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES, no entanto, é aconselhável a utilização de menos tecido para assegurar o fraccionamento adequado. </li><li> Transferir a amostra homogeneizada para trás to o mesmo tubo de 13 ml de polipropileno. Reserva de 100 ul de homogeneizado e armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western da fracção de proteína total. </li></ol> 4. baixa velocidade de centrifugação para remover a Fração Nuclear (Yields sobrenadante S1) <ol><li> Centrifugar o homogenato num rotor de ângulo fixo a 900 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (S1) para um novo, rotulado 13 ml tubo e ressuspender o sedimento de fracção nuclear (P1) em 500 mL de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. NOTA: O (P1) fracção pode ser armazenada a -80 ° C e utilizada para a análise de transferência western da fracção nuclear. </li></ol> 5. enriquecimento da fracção bruta sinaptossomais (Yields Pellet P2) <ol><li> Centrifuga-se o sobrenadante (S1) a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e 500 ul de reserva em um tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para subsequente quant proteínasificação e western blot da fração citosólica da membrana / light. Ressuspender o sedimento fracção sinaptosomal em bruto remanescente (P2) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES e, em seguida, adicionar uma outra solução de 3 ml de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. </li><li> Centrifuga-se a 10000 x g durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e de reserva de 500 ul num tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de Western blot da fracção citosólica membrana / luz. Salve o pellet sinaptosomal bruto lavado (P2 &#39;) no tubo de polipropileno. </li></ol> 6. Lise (hiposmótico Choque) da Fração Crude sinaptossomais <ol><li> Lise do sedimento sinaptosomal bruto (P2 &#39;) no tubo de polipropileno por ressuspensão lo em 1 ml de ddH 2 O. Adicionar mais 3 ml de DDH 2 O, transferir para um homogeneizador de tecido de vidro-Teflon, e homogeneizar à mão com três golpes. NOTA: É importantepara realizar esta etapa o mais rápido possível e rapidamente avançar para o passo 6.2. </li><li> Amostras de transferência do homogeneizador de volta na mesma 13 ml tubo de polipropileno e rapidamente ajustar a amostra de volta para HEPES 4 mM com 16 mL de uma solução M HEPES, inverter para misturar. </li><li> Rodar as amostras a 4 ° C durante 30 minutos para assegurar a lise completa. </li></ol> 7 Enriquecimento da Fração sinaptossomais Membrane (P3) <ol><li> Centrifuga-se a 25000 x g durante 20 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante fracção vesicular bruto (S3) e reservar com um tubo de 5 ml para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western. Ressuspender a fracção de membrana sinaptosomal (P3) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. </li></ol> 8 Preparação do gradiente de sacarose descontínuo <ol><li> Pipetar exactamente 3,5 ml de solução de sacarose 1,2 M tamponada com HEPES e exactamente 3,0 ml cada de 1,0 M e 0,8 M HEPESolução de sacarose tamponada-S em separado 6 ml encaixar tubos de capitalização. NOTA: Isto é feito a pré-medir os volumes dos buffers que são usados ​​para fazer o gradiente de sacarose. Medição exacta dos volumes é importante para assegurar que os gradientes resultantes irá ser equilibrada por ultracentrifugação. </li><li> Usando uma pipeta Pasteur e bulbo de vidro, transferir 1,2 M HEPES solução de sacarose a 12 ml polialómero tubo ultracentrífuga. Colocar cuidadosamente a solução de sacarose 1,0 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,2 M tamponado com HEPES. Por fim, a camada de solução de sacarose 0,8 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,0 M tamponado com HEPES. Use uma pipeta Pasteur fresco para cada solução de sacarose e tomar cuidado para não perturbar o gradiente de sacarose. As vibrações de um vórtice banco ou microcentrifuge vai perturbar a integridade do gradiente. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur, a camada de fracção de membrana sinaptosomal ressuspenso (P3) na parte superior do gradiente de sacarose descontínuo preparado.Certifique-se de que os gradientes são equilibradas por pesá-las dentro do balde da caçamba móvel rotor. Se os recipientes não estão equilibrados, utilizar uma pipeta de P200 para adicionar cuidadosamente sacarose 0,32 M tamponada com HEPES para o topo do gradiente e equilibrar os baldes de rotor. </li></ol> 9 Fracionamento do Plasma Membrane Synaptic (SPM) <ol><li> Ultracentrífuga num rotor basculante a 150.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Remova cuidadosamente os gradientes de sacarose dos baldes de ultracentrífuga. Usando uma agulha de 18 G e seringa de 1 ml, perfurar o tubo no fundo da solução de sacarose 1,0 M interfase / 1,2 M de HEPES e retirar a camada de membrana de plasma sináptico (SPM). </li><li> Anote o volume que cada amostra SPM ocupa na seringa de 1 ml. Coloque a camada SPM recolhido em 3,5 ml de tubos de ultracentrífuga de parede espessa, adicionar exactamente 2,5 volumes de HEPES 4 mM para ajustar a concentração de sacarose de 1,2 M a 0,32 M. Depois de cada amostra foi ajustared para 0,32 M de sacarose, equilibrar os tubos com solução de sacarose 0,32 M HEPES. </li><li> Ultracentrífuga num rotor de ângulo fixo a 200.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remova e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de membranas de plasma sináptico (SPM) em 300 ul de solução 50 mM de EDTA HEPES / 2 mM. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western. </li></ol> 10 Preparação da Fração densidade pós-sináptico (PSD) <ol><li> Descongele amostras SPM no gelo. </li><li> Adicione uma solução de 0,54% de Triton X-100 em solução de EDTA a 50 mM de HEPES / 2 mM. </li><li> Em um tubo de poliestireno de 5 ml, 2,7 ml de combinar de Triton X-100 / HEPES / solução de EDTA e 300 ul fracção SPM e girar a amostra durante 15 min a 4 ° C </li><li> Amostras de transferência para 3,5 ml tubos de ultracentrífuga de parede espessa e amostras centrifugar a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C. </li><li> Reservamo-nos o sobrenadante (Triton X-100 fração solúvel [TS]) e armazenar a -80; ° C. NOTA: Nesta fase, o pellet representa a fração &quot;PSD-1T&quot;. Um segundo tratamento com detergente vai produzir uma fracção de &quot;PSD-2T&quot;. Se uma fração PSD-1T é desejada, vá para o passo 10.6. <ol><li> Para produzir uma fracção PSD-2T, ressuspender o sedimento em 3 ml de 0,5% de Triton X-100 em 50 mM de HEPES / EDTA a 2 mM. Rodar as amostras durante 15 min a 4 ° C. Centrifugar as amostras a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C e vá para a etapa 10.6. </li></ol></li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o pós-sináptica (PSD) sedimento em solução de 50 HEPES / EDTA 2 mM. NOTA: O volume de ressuspensão pode depender do tamanho do pelete; Recomenda-se um volume de 50-75 mL. Porque a fracção PSD é uma fracção insolúvel em detergente, é muitas vezes necessário adicionar 1-2 mL de 0,5% de SDS, para permitir a ressuspensão completa de proteína. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Existem várias etapas do procedimento que são fundamentais para um bom resultado. No passo 3, é importante que um grau consistente de homogeneização é obtido para cada amostra. Quando homogeneizar o tecido com o homogeneizador accionado por motor, uma velocidade constante é utilizado não só para a rotação do pilão, mas também com o número de acidentes vasculares cerebrais. O tempo de incubação durante o choque osmótico deve ser mais preciso, uma vez que a homogeneização prolongada ou de incubação na solução hipotónica irá lisar mitocôndrias e contaminar a amostra SPM. Um outro passo crucial é na preparação de reagentes, especialmente as soluções de sacarose; se a molaridade da solução de sacarose está incorreto o procedimento não vai funcionar. Por conseguinte, as soluções de sacarose deve ser preparada por pesagem de sacarose, dissolvendo em solução 4 mM de HEPES, em seguida, adição de 4 mM de HEPES até ao volume final precisa. Dica Solução de problemas: construir um gradiente de teste com as soluções de sacarose preparados para enCertifique-se que o gradiente está devidamente montado. Adicionar várias concentrações de azul de bromofenol (por exemplo, concentração final de 0,005% -0,02% w / v) para a duas das três soluções de sacarose a auxiliar na visualização dos três camadas distintas. É importante limitar a quantidade de tempo entre o momento do gradiente é montada e quando os tubos são centrifugados. Difusão normal irá destruir o gradiente ao longo do tempo, e esta é acelerada se existe vibração no banco onde o gradiente é armazenado. Pré-pipetagem das soluções em alíquotas individuais permite volumes precisos de ser pipetados com uma pipeta Pasteur de vidro. Isto também reduz o tempo entre a montagem do gradiente e ultracentrifugação. Ponta resolução de problemas: construir um &quot;gradiente de ensaio&quot; com o corante azul de bromofenol como descrito acima, ao mesmo tempo que os gradientes de sacarose para o experimento. A integridade do gradiente pode assim ser monitorizado ao longo do tempo. O gradiente teste servirá como umindicador de difusão se os gradientes são montadas com muita antecedência ou estão expostos a vibração. Finalmente, é importante recolher a amostra SPM em um volume tão pequeno quanto possível, uma vez que é necessário diluir subsequentemente a amostra com 2,5 volumes de água. Idealmente, a amostra deve ser coletada em um volume de 0,4-0,7 ml utilizando uma seringa de 1 cc. Aconselha-se a construir os gradientes descontínuos durante a final 20 min rotação na etapa 7 para limitar o tempo entre a montagem de gradiente e ultracentrifugação. O protocolo inclui a recomendação de reservar todas as diferentes frações e armazená-los a -80 ° C para posterior análise. Demonstrámos o enriquecimento de proteínas pós-sinápticos na Figura 2, em apenas algumas destas fracções. No entanto, é aconselhável para medir os níveis de uma proteína de interesse em cada uma das fracções de compreender a sua distribuição. Comparando a distribbuição de uma proteína nas frações com outras proteínas marcadoras subcelulares também irá ajudar a confirmar que as condições experimentais alcançaram o fracionamento desejado. Tabela 2 resume marcadores de proteína comumente usados ​​que podem ser usados ​​como indicadores para as etapas de fracionamento 8,27- 38. A utilização do gradiente de sacarose descontínuo é amplamente utilizado para enriquecer as membranas de plasma sinápticas. Este método tem a vantagem sobre os gradientes de Percoll contínuos em que os gradientes de sacarose descontínuo são mais fáceis de fazer e não requerem equipamento especializado. No entanto, este método pode não ser suficiente para localização precisa de uma proteína de interesse, e para estas aplicações pode ser preferido um gradiente de Percoll.

Os neurônios se comunicam através de sinapses, ea qualidade desta comunicação é regulado, em grande medida por alterações na composição das proteínas na sinapse. Em particular, as proteínas localizadas na densidade pós-sináptica participar na comunicação neuronal por receptores de neurotransmissores intimamente andaime com os seus sistemas de transdução de sinal 1. Além disso, alterações na duração da força de eficácia sináptica são controladas por meio da adição ou remoção de receptores na densidade pós-sináptica 1-6. Portanto, o isolamento e quantificação de proteínas sinápticas é uma técnica útil e necessário para obter insights sobre os caminhos que os neurônios respondem a estímulos e alterar eficácia sináptica 7. Este artigo descreve uma técnica comum para isolar proteínas sinápticas de tecido cerebral dos roedores por ultracentrifugação em gradiente de sacarose descontínuo. A fracção de membrana de plasma sináptico podem ser enriquecidas e isoladas com base ema sua densidade em sacarose, que tenha sido determinada empiricamente para ser semelhante a 1,2 M de sacarose. Dependendo da causa biológica, fracções subcelulares podem ser separados por gradientes contínuos ou descontínuos de Percoll ou sacarose ou. Gradientes contínuos permitem a separação de proteínas em várias fracções; isto pode ser particularmente útil para demonstrar a co-localização de proteínas no interior de uma dada fracção 8. No entanto, a preparação de gradientes contínuos é mais trabalhoso e não é necessária para muitas aplicações. Gradientes descontínuos são comparativamente mais fáceis de preparar e pode ser usada para separar proteínas em algumas fracções, geralmente definidos. Gradientes descontínuos que são compostos por três camadas de aumento de sacarose molaridade têm sido amplamente utilizados para isolar as proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico (SPM). Esta fracção de membrana de plasma sináptico pode ser ainda processado para a fractio densidade pós-sináptican (PSD) por tratamento com detergente e isolamento da fracção insolúvel em detergente. Quando este processo foi descrito pela primeira vez na década de 1960 9,10, microscopia eletrônica foi utilizada para demonstrar as organelas e membranas que cerca definem a membrana plasmática sináptica e frações de densidade pós-sináptica 9-14. Estes estudos demonstraram a inclusão de membranas pré-e pós-sinápticos e vesículas sinápticas em fracção do SPM; após tratamento com detergente principalmente o elétron-denso, densidade pós-sináptica eram visíveis. No processo, um choque hipotónico é usado para comprimir fora os processos sinápticas do corpo da célula 10. Esta etapa leva vantagem de o facto de que as mitocôndrias são mais resistentes a choque osmótico e permanecem intactos, de modo que eles e sedimentam na parte inferior do gradiente de sacarose (Figura 1). Usando a mesma técnica de enriquecimento, as frações de SPM e PSD foram os primeiros bioquimicamentedefinido por electroforese em gel de poliacrilamida e sequenciação dos principais componentes proteicos 15-17. Análise de mancha ocidental Subsequentemente foi usado para detectar e quantificar os níveis de proteínas sinápticas e ainda definir estas fracções (Figura 2). Nós temos usado essa técnica em nossos laboratórios para quantificar mudanças nos níveis sinápticos do transportador de dopamina que ocorrem quando o locus SLC6A3 é duplicada em camundongos 18. Também tenho usado essa técnica em receptores NMDA camundongos deficientes para descobrir reduções específicas de sinapse em proteínas que fazem parte da DISC1 interactome 19. É evidente a partir da análise de Western blot que fracções SPM contêm proteínas de membrana de vesícula sináptica, marcadores endossoma, proteínas mitocondriais, enzimas associadas à membrana sintéticas e moléculas de transdução de sinal, bem como componentes integrais da densidade pós-sináptica e as membranas de plasma sinápticas 20-23. Efracções PSD ven pode ter contaminação com proteínas mitocondriais abundantes e pode ser necessário realizar um segundo gradiente de sedimentação ou de passos de purificação adicionais para removê-los 13. Recentemente, a espectrometria de massa quantitativo tem fornecido uma lista de mais de 100 proteínas na densidade pós-sináptica por si só, bem como uma indicação da abundância relativa destes componentes 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

Técnicas de fraccionamento subcelular neuronais permitir a quantificação de proteínas, que são objecto de tráfico de e para a sinapse. Tal como foi inicialmente descrito, no final dos anos 1960, as proteínas associadas à membrana plasmática sináptica pode ser isolado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez que as membranas sinápticas são isolados, o complexo macromolecular conhecido como a densidade pós-sináptica pode ser subsequentemente isolado devido à sua insolubilidade em detergente. As técnicas utilizadas para isolar membrana plasmática sináptica e proteínas de densidade pós-sináptica permanecer essencialmente o mesmo depois de 40 anos, e são amplamente utilizados em pesquisas de neurociência atual. Este artigo fornece detalhes sobre o fraccionamento de proteínas associadas com a membrana plasmática sináptica e pós-sináptica de densidade utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Resultantes preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

A preparação do gradiente de densidade de sacarose deve resultar em uma separação clara entre as três soluções molares de sacarose (0,8, 1,0 e 1,2 M de sacarose). Ver Figura 3A para um exemplo do gradiente é adicionado antes da amostra de proteína. Se o gradiente é preparado com muita antecedência, ou se ele é preparado em uma superfície de bancada com a vibração de outro equipamento, o gradiente será comprometida e separação adequada não será alcançado. Se uma separação clara entre as três soluções não é visível, é aconselhável fazer um novo gradiente antes de adicionar a amostra de proteína. Ver Figura 3B um exemplo do gradiente de sacarose, quando a amostra de proteína é adicionado (seta preta). Após a centrifugação, não devem ser claras bandas de fracções de proteínas em cada interfase (0,32 / 0,8, 0,8 / 1,0, 1,0 / 1,2). Além disso, uma pastilha deve ser visível na parte inferior do tubo. Ver Figura 3C para um exemplodas bandas de fracções após ultracentrifugação. Se fracções são apenas difusamente presente na interfase, é provável que o gradiente foi comprometida e o tratamento posterior não é aconselhada. Western blotting de amostras totais, SPM e proteína PSD1T de rato estriado é demonstrado na Figura 2. O enriquecimento de proteínas sinápticas como GluR1, PSD95, e CaMKII, podem ser visualizados através do carregamento de uma quantidade constante de proteína (10 ug) do total, a SPM e frações PSD. Proteínas Perisynaptic como o transportador de dopamina (DAT) são enriquecidos na fracção de SPM, mas são eliminados nas etapas detergentes subsequentes do processo de enriquecimento PSD. Para garantir um carregamento equivalente, os níveis de proteína pode ser visualizada na membrana de western blot de coloração com Ponceau Red 26. &quot;Controles de carga&quot; baseada em anticorpos são frequentemente relatados na literatura, mas isso pode ser um equívoco, pois as proteínas sinápticas pode ser diferentially regulamentada em grupos de tratamento experimental. Se um &quot;controle de carga&quot; à base de anticorpos é desejado, é aconselhável primeiro determinar carga de proteína equivalente por coloração Ponceau, e depois testar várias proteínas de referência para identificar aqueles que não mudam nos diferentes grupos experimentais. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Fluxo de trabalho de fracionamento subcelular para enriquecer SPM e frações protéicas PSD. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 blot Representante ocidental do total, SPM, e proteína PSD1T de rato striatum. 10 mg de extrato de proteína foram resolvidos em SDS-desnaturação, 10% acrílicogeles de amida, e transferidos para membranas de PVDF. Posteriormente estas membranas foram incubadas com anticorpos primários para αCaMKII, GluR1, PSD-93, e o PSD-95, os quais são todos os componentes da densidade pós-sináptica. Por conseguinte, estas proteínas são enriquecidos na SPM e fracções PSD. Alternativamente, membranas foram incubadas com um anticorpo primário em DAT, que está localizado em membranas pré-sinápticas no estriado. Enquanto DAT é enriquecido na fracção SPM, que não faz parte do complexo de PSD, e imunoreactividade não é observada na fracção PSD. Os anticorpos contra actina ou de sódio / potássio ATPase (bomba de Na / K) podem ser utilizadas como controlos de carga, embora algumas condições experimentais podem afectar os níveis destas proteínas, bem como o controlo da carga de modo adequado deve ser determinado empiricamente. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. </stRong&gt; exemplos representativos de gradiente de sacarose antes e após ultracentrifugação. A. Após o gradiente é preparada, deve haver três fases que são visíveis quando o tubo é mantido contra a luz. As setas brancas indicam a interfase entre 0,8 / 1,0 M de soluções de sacarose e 1,0 / 1,2 M de soluções de sacarose. B. Quando a amostra é colocado no topo do gradiente, isto é numa solução de sacarose 0,32 M e vai descansar em cima do 0,8 M camada de sacarose. C. Após a centrifugação, o homogeneizado irá separar-se em várias fracções. A fracção flutuante na interfase de 0,8 / 1,0 M de soluções de sacarose será enriquecida em membranas de mielina. A fracção na interfase de 1,0 / 1,2 M de soluções de sacarose representa a fracção SPM que é recolhido com uma agulha e seringa. O sedimento no fundo do tubo é enriquecida em proteínas mitocondriais. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Soluções </td><td> Sacarose HEPES </td><td> Os inibidores de protease </td><td> * inibidores de fosfatase </td></tr><tr><td> 1 M de HEPES pH 7,4 </td><td> 0,32 M de sacarose em HEPES 4 mM (pH 7,4) </td><td> PMSF 0,25 mM (estoque 250 mM em etanol, 1.000 vezes) </td><td> 10 mM Fluoreto de Sódio (estoque 500 mM, 50x) </td></tr><tr><td> 4 mM de HEPES pH 7,4 </td><td> 0,8 M de sacarose em HEPES 4 mM (pH 7,4) </td><td> 1,5 ug / ml de aprotinina (estoque de 1,5 mg / ml, 1.000 vezes) </td><td> 2,5 mM pirofosfato de sódio (estoque 250 mM, 100x) </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 1,0 M de sacarose em HEPES 4 mM (pH 7,4) </td><td> 10 ug / ml de leupeptina (estoque de 10 mg / ml, 1.000 vezes) </td><td> 1,0 mM b-glicerofosfato (estoque de 200 mM, 200x) </td></tr><tr><td> HEPES 50 mM (pH 7,4), 2 mM de EDTA </td><td> 1,2 M de sacarose em HEPES 4 mM (pH 7,4) </td><td> 0,1 mg / mL de Benzamidina (estoque de 100 mg / ml, 1.000 vezes) </td><td> 5.0mM de sódio ortovanadato (estoque de 500 mM, 100x) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10 ug / ml de pepstatina (stock 5 mg / ml em etanol, 500x) </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. reagentes necessários <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:88px;"> Fração </td><td style="width:191px;"> Fracção proteica </td><td style="width:335px;"> Marcador proteico </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P1 </td><td> nuclear </td><td> histona H1 27 </td></tr><tr height="72"><td height="72" style="height:72px;"> S1 </td><td> citosol / membranas </td><td style="width:335px;"> 28 calnexina (retículo endoplasmático), um 29-tubulina (citoesqueleto), GAPDH 30 (citosol), 58K Golgi prótein 31 (aparelho de Golgi) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P2 e P2 &#39; </td><td> sinaptosomas bruto </td><td style="width:335px;"> AMPA e NMDA subunidades do receptor 32 </td></tr><tr height="48"><td height="48" style="height:48px;"> S2 e S2 &#39; </td><td> citosol / membranas de luz </td><td style="width:335px;"> nNOS1 29 (citosol), GAPDH (citosol), LAMP1 33 (lisossomas), PEX14 34 (peroxissoma) </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> P3 </td><td> synaptosome / mitocôndria </td><td style="width:335px;"> VDAC 35 (mitocôndria), subunidades do receptor de AMPA e NMDA (sinaptossomas) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> S3 </td><td> vesículas sinápticas </td><td style="width:335px;"> SV2 8, sinaptofisina 8 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 0,8 M / 1,0 M </td><td> m<html> Yelin </td><td style="width:335px;"> proteína básica de mielina 36 </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> 1,0 M / 1,2 M </td><td> SPM </td><td style="width:335px;"> Subunidades AMPA e NMDA de receptores, marcador de pré-sináptico (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligina 32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 1.2 MP </td><td> mitocôndrias </td><td style="width:335px;"> VDAC 35 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;"> PSD (1T) </td><td> PSD </td><td style="width:335px;"> PSD93 32, PSD95 32, subunidades de receptor de AMPA e NMDA, neuroligin PICK1, 32, 32 CaMKII </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> TS </td><td> membranas pré-sinápticas </td><td style="width:335px;"> SNAP25, Munc18 37, Fagote 38, neurexin </td></tr><tr height="43">ight: 43px; &quot;&gt; PSD-2T </td><td> enriquecida PSD </td><td style="width:335px;"> Subunidades do receptor PSD95, AMPA e NMDA, PICK1, CaMKII </td></tr></tbody></table> Tabela 2 Lista de marcadores de proteína para distinguir frações subcelulares

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Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K visualizações.  University of Toronto.  Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE. 

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Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

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Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurociência

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Isolamento de locais de contato mitocondrial

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor em destaque: Revelando locais de contato mitocondrial e insights arquitetônicos 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Resumo

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Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem