Isolamento de células epiteliais primárias do túbulo proximal humano e seu uso na criação de um modelo microfisiológico do túbulo proximal renal

Apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de rins humanos inteiros para isolar e cultivar células epiteliais primárias do túbulo proximal renal e a aplicação dessas células em uma plataforma microfluídica tridimensional e microfisiológica para recapitular o túbulo proximal renal.

A doença renal afeta mais de 850 milhões de pessoas em todo o mundo, incluindo 37 milhões de americanos. Os fatores de risco para doença renal crônica incluem influências ambientais, predisposições genéticas, condições médicas coexistentes e história de lesão renal aguda. Esses fatores geralmente levam meses ou anos para se desenvolver, complicando os estudos longitudinais de etiologia e fisiopatologia da doença. Modelos renais avançados são necessários para melhorar nossa compreensão dos mecanismos da doença e melhorar a previsão de nefrotoxicidade no desenvolvimento de medicamentos. As células epiteliais do túbulo proximal (PTECs) no rim desempenham um papel crítico na depuração de xenobióticos e toxinas, bem como na reabsorção de nutrientes essenciais. Demonstramos anteriormente que plataformas de sistema microfisiológico (MPS) tridimensionais (3D), preenchidas com PTECs primários isolados, podem ser usadas para investigar interações medicamentosas renais, avaliar a nefrotoxicidade de compostos e prever a depuração de medicamentos. Aqui, apresentamos protocolos para isolar e cultivar PTECs primários de rins humanos inteiros e para semeá-los em uma plataforma MPS 3D que imita a fisiologia renal in vivo . Este protocolo permite estudos de longo prazo que apoiam a viabilidade do PTEC, morfologia fisiológica e polarização funcional das principais proteínas transportadoras em dispositivos MPS por até 6 meses.

O rim desempenha um papel crítico na depuração e eliminação de uma ampla gama de xenobióticos, toxinas e compostos endógenos do corpo. Isso é conseguido filtrando o sangue para remover resíduos e regulando o equilíbrio eletrolítico, os níveis de fluidos e o pH. Cada rim humano contém cerca de um milhão de néfrons, as unidades estruturais e funcionais do rim¹. Dentro desses néfrons, células epiteliais especializadas nos túbulos proximais, conhecidas como células epiteliais do túbulo proximal (PTECs), são responsáveis pela reabsorção de moléculas essenciais, como glicose, aminoácidos e íons, bem como pela secreção de substratos de drogas e substâncias potencialmente tóxicas na urina ^2,3,4. Em alguns casos, os PTECs também podem reabsorver compostos da urina de volta para a corrente sanguínea⁴. Devido ao seu papel crítico nas interações medicamentosas e toxinas, os PTECs primários isolados de rins humanos fornecem uma ferramenta valiosa para estudar as interações medicamentosas renais (DDIs) e avaliar a nefrotoxicidade dos compostos.

A nefrotoxicidade induzida por drogas representa um desafio clínico significativo, pois pode levar a lesão renal aguda e doença renal crônica⁵. Portanto, uma compreensão mais profunda da fisiologia do túbulo proximal renal é essencial para prever e caracterizar com precisão o potencial nefrotóxico de drogas e toxinas. Modelos in vitro tradicionais, incluindo linhagens de células renais imortalizadas (por exemplo, RPTEC-TERT1, HK-2), têm limitações em mimetizar a estrutura complexa e a função dos túbulos proximais humanos⁶, que operam sob fluxo laminar dinâmico (com baixo número de Reynolds) e uma matriz extracelular (MEC) uniforme in vivo ^7,8. Além disso, os modelos bidimensionais (2D) tradicionais muitas vezes falham em expressar funcionalmente os principais transportadores renais (por exemplo, transportador de ânions orgânicos 1 e 3 (OAT1 e OAT3), transportador de cátions orgânicos 2 (OCT2)) devido à rápida degradação e internalização dessas proteínas 6,9,10,11 . Os modelos animais, embora informativos, podem não replicar totalmente a fisiologia renal humana e muitas vezes carecem de traduzibilidade devido às diferenças de espécies na expressão e atividade do transportador¹². Por exemplo, mOct1 é expresso basolateralmente em PTECs de camundongos, enquanto em humanos, a expressão da proteína de membrana de OCT1 no rim é indetectável ^13,14.

Os avanços nos sistemas microfisiológicos (MPS) e nas tecnologias de órgãos em um chip permitiram que os pesquisadores desenvolvessem modelos in vitro que imitam de perto a arquitetura tridimensional (3D) e as condições dinâmicas de fluxo de fluidos dos órgãos humanos¹⁵. Nosso grupo caracterizou anteriormente dois modelos de MPS com PTECs^16,17 e utilizou esses modelos para conduzir estudos de toxicidade 18,19,20 e prever a disposição do medicamento^{com precisão 21}. O uso de PTECs primários nesses modelos oferece vantagens significativas devido à sua capacidade de reter características funcionais observadas in vivo.

Aqui, apresentamos os protocolos para o isolamento de PTECs humanos de um rim humano intacto obtido de um doador falecido por meio de uma organização de aquisição de órgãos aprovada pela United Network for Organ Sharing (UNOS) e aplicando esses PTECs humanos cultivados em uma plataforma MPS.

Todo o trabalho foi conduzido em conformidade com as diretrizes de manuseio de tecidos humanos da Universidade de Washington. Os doadores adequados atendem aos seguintes requisitos: menos de 36 h de tempo isquêmico frio (CIT), sem histórico conhecido de doenças renais, diálise ou quaisquer outras condições médicas (por exemplo, diabetes mellitus tipo 1 ou 2, hepatite B, hepatite C, vírus da imunodeficiência humana (HIV), meningite viral/bacteriana, infecção por Staphylococcus aureus resistente à meticilina, sífilis, sepse ou Covid-19). Todos os rins humanos usados neste estudo foram obtidos por meio de um OPO aprovado pela UNOS.

1. Preparação do gabinete de biossegurança

1. Pulverize o capô com etanol a 70%. Descontamine todas as superfícies e itens dentro do gabinete para criar um ambiente estéril.
2. Coloque almofadas absorventes azuis. Execute todo o trabalho de tecido sobre essas almofadas.
3. Certifique-se de que o equipamento necessário esteja disponível na cabine de biossegurança e devidamente esterilizado (lâminas de barbear, pontas de pipeta sorológica, pistola de pipeta sorológica, filtros de células de 100 μm, ponteiras p1000, micropipeta de 1000 μL, placas de cultura circulares de 15 cm e tubos cônicos).

2. Preparação de pré-processamento renal

1. Prepare a solução de digestão renal adicionando 0,75 mg / mL de colagenase IV + 0,75 mg / mL de dispase II na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) com cálcio e magnésio. Filtrar a solução através de um filtro de membrana estéril de 0,2 μm.
   NOTA: Para um rim adulto humano inteiro, são necessários aproximadamente 14 tubos cônicos de 50 mL, cada um contendo ~ 35 mL de solução de digestão (totalizando 500 mL).
2. Prepare o meio PTEC adicionando 4,425 g de meio de Eagle modificado (DMEM) / F12 pó de Dulbecco sem glicose, 0,5 g de pó de D-glicose, 0,6 g de pó de bicarbonato de sódio, 5 mL de suplemento de insulina-transferrina-selênio 100x (contendo 1000 mg / L de insulina, 550 mg / L de transferrina e 0,67 mg / L de selenito de sódio), 0,5 mL de 50 μM de hidrocortisona e 5 mL de solução antibiótica-antimicótica 100x (contendo 10000 unidades / mL de penicilina G de sódio, 10000 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B em solução salina a 0,85%) em 500 mL de água ultrapura autoclavada estéril (Tipo 1). Filtrar o meio através de um filtro de membrana estéril de 0,2 μm. Descongele o soro fetal bovino (FBS) e faça alíquotas de 10 mL em 14 tubos cônicos de 50 mL.
3. Reúna e rotule um conjunto adicional de tubos cônicos de 50 mL. Nesta etapa, certifique-se de que haja 3 conjuntos de 14 tubos de 50 mL.
4. Pré-aqueça o agitador orbital a 37 °C.

3. Isolamento de PTECs de todo o rim

1. Usando uma técnica estéril, coloque o contêiner de transporte com a amostra de tecido na capa de biossegurança. Retire o saco da caixa e borrife a parte externa com etanol 70% antes de colocá-lo no capô.
2. Coloque o rim em uma placa de cultura redonda de 15 cm. Aspirar/Descartar a mídia restante.
3. Remova a gordura circundante e a cápsula renal usando lâminas de barbear estéreis. Marque suavemente a cápsula renal para criar uma fenda no centro.
4. Usando uma pinça, retire a cápsula e use lâminas de barbear para cortar qualquer gordura presa ao rim. Rejeitar a cápsula e a gordura noutra placa de cultura de 15 cm.
5. Separe o córtex (~ 1 cm de espessura) da medula. Descarte a medula.
   NOTA: O córtex tem uma cor amarelo-acastanhada mais clara em comparação com a medula.
6. Usando uma lâmina de barbear, pique o tecido em <1 cm³ pedaços até obter uma aparência de pasta.
7. Adicione uma pequena quantidade de tampão de digestão renal no prato e transfira a pasta para o primeiro conjunto de tubos de 50 mL contendo 35 mL da solução de digestão renal. Distribua uniformemente e não exceda um volume total de 45 mL para cada tubo.
8. Transfira todos os tubos para o agitador orbital a 37 °C e incube por 30 min na velocidade mais alta que não cause a queda dos tubos. Transfira os tubos de volta para o gabinete de biossegurança após pulverizá-los com etanol 70%.
9. Inverta os tubos para misturar e permitir que os pedaços maiores de tecido se depositem no fundo. Transfira o máximo possível da solução para os tubos cônicos de 50 mL contendo 10 mL de soro fetal bovino (FBS) sem transferir tecido intacto. Distribua uniformemente e não exceda um volume total de 45 mL para cada tubo.
10. Centrifugar os tubos a 200 g durante 7 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70%.
11. Aspire cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 10 mL de meio PTEC em cada tubo e ressuspenda os pellets.
12. Coe as suspensões celulares resultantes através de filtros celulares de 100 μm em novos tubos cônicos de 50 mL.
13. Centrifugue os filtrados celulares resultantes a 400 g por 5 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70%.
14. Lave os pellets com 5 mL de DPBS. Ressuspenda os pellets usando uma ponta p1000.
15. Centrifugar os tubos a 400 g durante 5 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70% e, em seguida, aspire os sobrenadantes.
16. Repita a etapa 3.15 mais duas vezes para um total de três lavagens. Em seguida, ressuspenda os grânulos celulares com 15 ml de meio PTEC e coloque as células em frascos estéreis de cultura de células T-75.
17. Rotular os frascos adequadamente e deixar as células crescerem numa incubadora estéril a 37 °C e 5% de CO₂. Permita que os PTECs cresçam sem perturbações na incubadora por 48 h antes da primeira troca de meio.

4. Mudanças de mídia

1. Aspirar os meios dos frascos.
2. Lave as células com 5 mL de DPBS pré-aquecido.
3. Adicionar 5 ml de meio PTEC pré-aquecido aos balões T-25.
4. Retorne o frasco à incubadora.
5. Mudar o meio de 48 em 48 h até que o balão atinja pelo menos 70% de confluência para passagem ou utilização em experiências.

5. PTECs de passagem

1. Aspirar o meio do balão. Adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido em cada frasco T-25 e incube a 37 ° C por 1 a 2 min para permitir a digestão da tripsina.
2. Uma vez que as células são destacadas, neutralize a tripsina com 5 mL de solução inibidora de tripsina definida pré-aquecida.
3. Ressuspenda 5 vezes para desalojar quaisquer células ainda presas ao frasco. Em seguida, transfira a suspensão da célula para tubos cônicos de 15 mL e centrifugue a 400 g por 5 min.
4. Aspire o sobrenadante.
   NOTA: Pare aqui para criopreservar PTECs e mude para esse protocolo.
5. Ressuspenda os grânulos celulares com 14 mL de meio PTEC por tubo. Transferir as suspensões celulares para balões T-75 (1 tubo por balão).
6. Execute um T-shake para distribuir as células uniformemente pelo balão. Monitore as células e troque a mídia a cada 48 h.

6. PTECs de criopreservação

1. Após a etapa 5.6., ressuspenda os grânulos celulares em 2 mL de meio PTEC com 10% de DMSO e 90% de baixa glicose para cada tubo cônico de 15 mL e transfira 1 mL para um criovial.
2. Transfira os criogenianos para um recipiente de congelamento de células que permita o congelamento com temperatura controlada e coloque o recipiente em um freezer a -80 °C por 24 h. Após 24 h a -80 °C, transferir os criogenianos para um tanque de azoto líquido para armazenamento a longo prazo.

7. Descongelamento de PTECs

1. Descongelar o frasco a -80 °C em banho-maria a 37 °C. Não descongele à temperatura ambiente (RT). Uma vez que o frasco tenha sido parcialmente descongelado (deve haver um pequeno pedaço de gelo visível), adicione 1 mL de suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL com 10 mL de meio PTEC pré-aquecido.
2. Gire a suspensão celular a 400 g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de meio PTEC pré-aquecido com baixo teor de glicose.
3. Transfira a suspensão de células de 5 ml para um balão T-25 e execute um T-shake para distribuir as células uniformemente pelo frasco. A partir daqui, siga a seção 4 para alterações de mídia.

8. Revestindo o dispositivo MPS com matriz de colágeno tipo I

1. Aspire o PBS do dispositivo MPS e remova o dispositivo da embalagem. Seque o dispositivo com lenços umedecidos e etiquete-o conforme desejado.
2. Coloque o dispositivo MPS em uma placa de cultura circular de 15 cm e coloque-o a 4 °C até que esteja pronto para uso. Mantenha lenços umedecidos no fundo do prato para evitar umidade no dispositivo MPS.
3. Manter seringas de 1 ml com agulhas Luer-Lok de 22 G fixadas a -20 °C até à utilização para injeção de colagénio I.
4. Para cada quatro dispositivos MPS que precisam ser preenchidos, mantenha um tubo cônico de 15 mL no gelo. Use uma seringa de 1 mL com a agulha sem corte acoplada para cada tubo cônico de 15 mL.
5. Usando uma técnica estéril em um gabinete de biossegurança, abra todas as portas do dispositivo MPS. Certifique-se de que as fendas na parte superior de cada válvula de parafuso estejam alinhadas verticalmente com a porta.
6. Usando um conjunto rombo de seringa/agulha de 1 mL, lave a câmara ECM com 1 mL de etanol nas portas #1, #3 e #6. Aspire o etanol e deixe-o evaporar completamente (pelo menos 30 s) para que não penetre no dispositivo MPS das portas #2, #4 e #5.
7. Coloque o dispositivo MPS de volta a 4 °C e mantenha o meio PTEC, M199 e 1 N NaOH no gelo.
8. Calcule a composição da matriz para 1 mL da mistura de colágeno Tipo I para aproximadamente quatro dispositivos MPS de acordo com a Tabela 1 (escala conforme necessário). No gabinete de biossegurança, misture o meio PTEC, M199 e 1 N NaOH nesta ordem, de acordo com os cálculos acima, e mantenha todos os tubos no gelo.
9. Adicione cuidadosamente o estoque de colágeno Tipo I com uma seringa de 1 mL à mistura pré-fabricada. Misture a mistura de colágeno pipetando para cima e para baixo até que a mistura tenha uma cor laranja-rosa salmão estável.
10. Centrifugue brevemente o tubo para coletar a solução na parte inferior. Certifique-se de que não haja bolhas na solução.
11. Coloque as seringas pré-resfriadas de 1 mL com agulhas Luer-Lok de 22 G e o dispositivo MPS na cabine de biossegurança e no gelo. Encha a seringa pré-resfriada de 1 mL com a mistura de colágeno e evite bolhas completamente.
12. Muito lenta e suavemente injete a solução de colágeno nas portas # 1, # 3 e # 6 das câmaras do dispositivo resfriado. Segure o dispositivo verticalmente com as portas voltadas para baixo para permitir que as bolhas de ar fluam para cima e para fora das portas #2, #4 e #5.
    NOTA: Deve haver uma gota da mistura de colágeno nas portas # 2, # 4 e # 5, o que indica que as câmaras estão totalmente revestidas.
13. Retire a seringa e volte a colocá-la no tubo de 15 ml sobre gelo. Gire a válvula de parafuso para as portas #2, #4 e #5 para selar o cavaco cheio e coloque o cavaco na placa de cultura a 4 °C por 30 min.
14. Após 30 min, transfira o chip com o prato para o armário de biossegurança de maneira estéril e espalhe os chips de maneira uniforme e individual para que aqueçam uniformemente.
15. Coloque um lenço umedecido em cada prato (para evitar que a matriz de colágeno I seque e descasque das paredes do dispositivo MPS) e sele os pratos com um filme de vedação flexível semitransparente. Deixe o colágeno polimerizar durante a noite em RT.

9. Criando um lúmen tubular com colágeno tipo IV como ECM em um dispositivo MPS

1. Esterilize a tubulação C-flex lavando os tubos com água ultrapura (Tipo 1) e etanol puro e, em seguida, autoclave toda a linha de tubos.
2. No gabinete de biossegurança, abra todas as portas do dispositivo MPS preenchido com colágeno Tipo I (a válvula de parafuso ficará vertical com as portas) e remova o fio que se projeta das portas #1, #3 e #6 para formar os lúmens tubulares.
3. Insira os acopladores de metal nas portas #1, #3 e #6.
4. Prepare uma solução de 10 ml de 5 μg/ml de colagénio tipo IV em meio PTEC.
5. Insira 24 polegadas de tubo C-flex estéril nos blunts de metal que se projetam das portas #1, #3 e #6.
6. Encha as seringas de 1 mL equipadas com uma agulha Luer-Lok 22-G sem corte com 0,5 mL de solução de colágeno tipo IV.
7. Coloque a seringa cheia em uma bomba de infusão de seringa e conecte a tubulação da porta #1 à seringa. Repita esta etapa para as portas #3 e #6.
8. Usando a bomba de seringa, administre a solução de colágeno Tipo IV nas portas MPS a uma taxa de 10 μL/min por 30 min. Uma vez que as portas tenham sido infundidas, deixe o colágeno solidificar em uma incubadora a 37 ° C durante a noite antes de usá-los no dia seguinte.
   NOTA: Os dispositivos MPS revestidos com colágeno tipo IV podem ser armazenados por até 1 semana a 4 °C.

10. Semeando PTECs primários em um dispositivo MPS

1. Inspecione o dispositivo MPS sob o microscópio para garantir que o lúmen se formou corretamente.
2. Coloque uma seringa pré-esterilizada de 5 mL com uma agulha de 22 G em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de etanol.
3. Obtenha um pellet de célula PTEC em um tubo cônico de 15 mL de um frasco T-25 seguindo as etapas 5.1. para 5.3. Adicione 80 μL de meio PTEC ao pellet celular e ressuspenda suavemente.
4. Transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mL.
5. Retire o prato que contém o dispositivo MPS da incubadora e coloque-o no gabinete de biossegurança. Feche as portas #2, #4 e #5 e gire a válvula de parafuso horizontalmente para as portas.
6. Agite suavemente o tubo contendo PTEC para ressuspender as células. Encha a seringa com células e insira a agulha na porta de injeção mais distante das portas das válvulas de parafuso.
7. Empurre cuidadosamente o êmbolo da seringa para injetar as células. Visualize as células após a injeção ao microscópio.
   NOTA: As células devem estar se movendo através do lúmen. Se nenhuma célula for observada no lúmen, verifique se a agulha foi inserida com segurança na porta de injeção e reinsira a agulha, se necessário. Uma seringa cheia de células pode preencher todos os três lúmens do dispositivo.
8. Continue as injeções de células com as outras duas portas. Após as injeções, feche as portas #2, #4 e #5 e coloque o dispositivo MPS de volta na incubadora a 37 °C. Mantenha a placa nivelada para que as células não saiam do lúmen por gravidade.
9. Para dispositivos MPS adicionais, lave a seringa com etanol após o esvaziamento e lave com DPBS antes de aspirar as células.
10. Permita que os dispositivos MPS permaneçam durante a noite sem serem perturbados.
11. No dia seguinte, conecte os dispositivos MPS às bombas de seringa.
12. Na cabine de biossegurança, encha as seringas de 5 mL com meio PTEC. Em seguida, encaixe os blunts de ponta Luer-Lok de 22 G com a seção de 24 polegadas do tubo C-flex preso às seringas.
13. Coloque as seringas carregadas com meio PTEC na bomba de seringa. Prepare as linhas para remover quaisquer bolhas de ar.
14. Conecte as linhas de tubulação preparadas às portas #1, #3 e #6 e gire as válvulas de parafuso para a posição vertical para introduzir o fluxo de mídia.
15. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa em 0.5 μL/min. Colocar a placa com o dispositivo MPS de volta na incubadora a 37 °C e deixar as células formarem túbulos (dentro de 5 a 7 dias) sob perfusão contínua do meio antes de iniciar uma experiência.

Morfologia e confluência de PTECs primários isolados ao longo do tempo em cultura 2D
Após o isolamento do córtex renal, os PTECs cresceram sem perturbações por pelo menos 48 h antes da primeira mudança de meio. Aproximadamente uma semana após a cultura das células, pequenos lotes de PTECs devem aparecer em todo o frasco de cultura com uma morfologia epitelial uniforme, semelhante a paralelepípedos (Figura 1A, B). Dependendo das taxas de crescimento de PTECs de diferentes doadores, a confluência celular deve atingir aproximadamente 50%-60% após 10 dias em cultura (em média) (Figura 1C). Após aproximadamente 14 dias em cultura, as células devem atingir a confluência total (Figura 1D) e estão prontas para serem passadas, criopreservadas ou semeadas em um dispositivo MPS. Em média, um rim humano inteiro é capaz de fornecer 14 frascos T-75 cheios de PTECs. Para evitar a contaminação, é essencial empregar técnicas estéreis e incluir antibióticos no meio durante o período de cultura.

Injeção de PTECs em um dispositivo MPS
Depois que os dispositivos MPS são revestidos com colágeno Tipo I e Tipo IV, eles estão prontos para a cultura de PTECs em formato 3D. Conforme mostrado no Vídeo 1 e na Figura 2, os PTECs podem ser vistos fluindo no lúmen a partir da porta de injeção (Figura 3). Se não forem observadas células, isso pode indicar vazamento ou desalinhamento da injeção e da agulha da seringa romba. Como mostrado em estudos publicados anteriormente ^17-28, os túbulos PTEC se formarão aproximadamente uma semana após a injeção em um dispositivo MPS.

Figura 1: Morfologia e confluência de células epiteliais primárias isoladas do túbulo proximal (PTECs) ao longo do tempo. Os PTECs isolados de um único rim adulto são normalmente plaqueados em 14 frascos de cultura de células T-75. (A) Para este rim representativo, após 6 dias em cultura, pequenas manchas de PTECs (encaixotadas em vermelho) com aparência epitelial e semelhante a paralelepípedos puderam ser observadas em todo o frasco de cultura de células, com células sanguíneas ainda visualmente presentes. (B) No dia 8, adesivos PTEC definidos apareceram com células sanguíneas reduzidas após a mudança de meio. (C) A confluência atingiu 50 a 60% no dia 10, em média, e (D) atingiu aproximadamente 100% cerca de 2 semanas após o isolamento e estão prontos para serem passados, criopreservados ou usados em um dispositivo MPS. As imagens foram tiradas com aumento de 4x usando um microscópio. As barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho para criar um modelo de túbulo proximal usando PTECs em uma plataforma MPS. Este fluxograma descreve o fluxo de trabalho geral para o uso de PTECs em um dispositivo MPS. Geralmente, leva aproximadamente 3 semanas para isolar PTECs de rins humanos para criar um túbulo proximal 3D maduro e estável in vitro . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: PTECs após serem injetados em um dispositivo MPS. Após a formação do lúmen no dispositivo MPS com colágeno I e IV, os PTECs podem ser injetados. Conforme mostrado nesta figura e no vídeo, após a injeção correta dos PTECs, as células podiam ser vistas fluindo através do lúmen da porta de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Cálculos de amostra para preparar 1 mL da mistura de revestimento de colágeno MPS tipo I. O volume de colágeno necessário deve ser ajustado de acordo com a concentração de estoque. O volume do meio PTEC pode ser ajustado para aumentar ou diminuir o volume total para aproximadamente 1 mL.

Vídeo 1: PTECs fluindo no lúmen a partir da porta de injeção. Clique aqui para baixar este vídeo.

MPS, ou tecnologias organ-on-a-chip, oferecem uma plataforma in vitro altamente relevante para recapitular aspectos-chave da fisiologia humana, reduzindo assim a dependência de modelos animais no desenvolvimento de medicamentos e avaliações toxicológicas. Recentemente, a Lei de Modernização 2.0 da FDA (2022) permitiu a inclusão de MPS, entre outras alternativas, em aplicações de Novos Medicamentos Investigacionais²⁹. Este protocolo detalha um procedimento operacional padrão para a dissociação de PTECs do tecido cortical de doadores humanos e seu uso subsequente em plataformas MPS, com o objetivo de modelar a função do túbulo proximal humano e avaliar as respostas toxicológicas renais a xenobióticos (Figura 2).

Um fator importante para manter a alta viabilidade do PTEC é minimizar o tempo isquêmico quente (WIT). Recomendamos o uso de rins com menos de 1 h de WIT. Embora a CIT abaixo de 24 h seja ideal, até 36 h podem ser toleradas quando a disponibilidade renal é limitada. Outra etapa crítica é a preparação adequada do tecido, que inclui a remoção das membranas externas, gordura visceral e separação completa do córtex da medula para maximizar a pureza do PTEC. Descobrimos que digerir o tecido com colagenase IV e dispase em vez de colagenase I sozinha 10,11,30,31 oferece uma dissociação mais suave que preserva a integridade da membrana celular. Além disso, outras misturas ou a inclusão de DNase podem ser benéficas quando há detritos celulares significativos ou aglomeração de células na suspensão. É também essencial picar os tecidos em pedaços com menos de 1 cm³ e mantê-los frios no gelo ou a 4 °C imediatamente após a digestão para evitar danos celulares excessivos.

Para aplicações de curto prazo de PTECs em plataformas de cultura estáticas, como transwells, a remoção da maioria dos glóbulos vermelhos durante o processamento tecidual é fundamental para prevenir o estresse oxidativo causado pela hemoglobina livre³². Diferentes tipos de células no córtex renal, incluindo células sanguíneas, podem ser separados usando um gradiente de Percoll³³. Alternativamente, as células sanguíneas podem ser lisadas seletivamente usando um tampão à base de cloreto de amônio³⁴. Por outro lado, ao usar PTECs em dispositivos MPS, níveis moderados de células sanguíneas contaminantes podem ser tolerados, pois esses PTECs precisam ser cultivados em um formato de cultura padrão até a confluência. Além disso, a digestão prolongada além de uma hora deve ser evitada, pois pode aumentar drasticamente o risco de contaminação que pode não ser resolvido simplesmente adicionando agentes antimicrobianos. Uma digestão de 30 minutos geralmente fornece suspensões unicelulares adequadas e, se o rendimento for menor do que o esperado, lavar o tecido digerido uma ou duas vezes adicionais com tampões isotônicos, como o PBS, muitas vezes pode liberar PTECs que aderem ao tecido parcialmente digerido. Se a viabilidade celular for baixa ou a adesão for retardada, é aconselhável reexaminar a digestão, garantir o mínimo de WIT e confirmar se as condições do meio de cultura (hormonalmente definido, sem soro, 1 g/L de glicose) estão corretas. Verificar se as etapas pós-digestão são realizadas no gelo ou a 4 °C (até o plaqueamento) também é essencial para reduzir o estresse celular. Para a semeadura celular subsequente nas plataformas MPS, é importante não introduzir bolhas de ar ao revestir com soluções de colágeno para manter um ECM uniforme para que os PTECs formem túbulos estruturados. As técnicas estéreis são especialmente importantes durante a configuração da MPS, uma vez que a natureza multicompartimental dos dispositivos MPS aumenta o risco de contaminação.

Uma das principais limitações desse protocolo é a dependência de tecidos de doadores, que podem variar em qualidade e disponibilidade. WIT prolongado ou alto CIT podem reduzir o rendimento celular viável e limitar a reprodutibilidade experimental. Outra limitação é a vida útil finita dos PTECs primários, que normalmente podem ser mantidos por 3 a 4 passagens antes que ocorra a senescência celular. Por fim, este método produz inicialmente uma população mista de células, que contém PTECs e células epiteliais do túbulo distal (DTECs), após a digestão do córtex renal. Embora isso possa não ser ideal para aplicações de curto prazo, o objetivo é propagar os PTECs para uso subsequente em plataformas MPS. Como empregamos um meio de cultura definido sem soro, outros tipos de células de porcentagens muito mais baixas, ou seja, células mesangiais e fibroblastos, não crescerão a uma taxa significativa. Além disso, usando citometria de fluxo e coloração imuno-histoquímica (IHC), demonstramos anteriormente que a maioria das células primárias cultivadas usando esse método são PTECs, com uma minoria de células expressando marcadores DTEC com base nos dados de coloração de marcadores de células epiteliais renais. Especificamente, os PTECs cultivados em 3D formam túbulos polarizados com fenótipo de citometria de fluxo PTEC para neprilisina (CD10) e alanina aminopeptidase (CD13)²³. Os dados de coloração IHQ também demonstraram que essas células, nos formatos 2D e 3D, expressam marcadores PTEC lectina de lótus tetragonolobus (LTL), cotransportador de sódio-glicose 2 (SGLT2) e aquaporina-1 (AQP1), com expressão mínima de marcadores de néfrons distais, incluindo prominina-2 (PROM2), uromodulina (UMOD) e aquaporina 2 (AQP2)¹⁶. Isso é esperado, uma vez que os DTECs demonstraram se desdiferenciar e transdiferenciar em relação aos PTECs em cultura 2D³⁰.

Embora as culturas de células renais estáticas e as linhagens celulares imortalizadas sejam amplamente utilizadas, elas geralmente não conseguem replicar os níveis fisiológicos de estresse de cisalhamento e a arquitetura tridimensional encontrada no rim. Em contraste, as plataformas 3D MPS aproximam melhor o ambiente do túbulo proximal in vivo, incorporando andaimes de fluxo e ECM, aumentando assim a precisão preditiva para avaliações de nefrotoxicidade, como mostramos anteriormente 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27^,28. O uso de PTECs primários em vez de linhagens imortalizadas confere maior relevância fisiológica, pois essas células retêm transportadores e enzimas essenciais para o metabolismo e depuração de xenobióticos. A combinação de manuseio cuidadoso de tecidos, digestão enzimática otimizada e condições de cultura adequadas garante que este método MPS esteja alinhado com os objetivos gerais de reduzir os testes em animais e, ao mesmo tempo, aumentar o valor translacional da pesquisa renal pré-clínica²⁹.

Este protocolo permite o estabelecimento de modelos robustos de túbulos proximais humanos em dispositivos microfisiológicos, facilitando assim a triagem de medicamentos, previsões de nefrotoxicidade e investigações detalhadas da fisiopatologia renal, particularmente para mecanismos de depuração renal, interações entre medicamentos e transportadores e vias de lesão renal. Ao reduzir ou substituir o uso de modelos animais, essas abordagens primárias de MPS baseadas em humanos promovem o princípio dos 3Rs (reduzir, refinar, substituir) e podem acelerar os pipelines de desenvolvimento de medicamentos. Ao mesmo tempo, a MPS específica do paciente é promissora para aplicações de medicina de precisão, como triagem personalizada de medicamentos e perfil de toxicidade. No geral, este método reprodutível para isolar e cultivar PTECs de tecidos de doadores humanos fornece etapas críticas para preservar a viabilidade e a funcionalidade celular e, quando combinado com plataformas 3D MPS, melhora significativamente o poder preditivo dos modelos renais in vitro enquanto avança na pesquisa toxicológica e na descoberta de medicamentos.

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse ou divulgações financeiras relevantes para este estudo.

Partes deste trabalho foram apoiadas pelo contrato da NASA 80ARC023CA001, o Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), em conjunto pelo NCATS e o Centro para o Avanço da Ciência no Espaço (CASIS) (UG3TR002178), o Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (NIEHS) (P30ES00703), o Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (T32GM007750), um presente irrestrito dos Centros Renais do Noroeste para a Pesquisa Renal e a Escola de Farmácia da Universidade de Washington (Prêmio Ji-Ping Wang e Bradley Fellowship).