Transplante cirúrgico de células tumorais na medula espinhal de camundongos

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

Os gliomas da medula espinhal são comumente tumores malignos da medula espinhal, levando a uma alta taxa de incapacidade. No entanto, diretrizes de tratamento uniformes e dados abrangentes sobre gliomas da medula espinhal permanecem limitados devido à falta de modelos animais pré-clínicos adequados. O desenvolvimento de um modelo animal simples e reprodutível tornou-se essencial para o avanço da pesquisa básica e translacional. Um modelo murino é ideal, pois a medula espinhal murina compartilha semelhanças estruturais com a medula espinhal humana. Este protocolo descreve a geração de um modelo murino reprodutível de glioma da medula espinhal por meio da injeção direta de células tumorais no espaço intervertebral usando o processo espinhoso da sétima vértebra cervical como guia. Em comparação com outros métodos, essa abordagem é mais eficaz e conveniente, envolvendo uma incisão menor, redução da invasividade e perda de sangue, recuperação mais rápida e formação de tumor mais estável. Espera-se que este modelo avance na compreensão dos mecanismos da doença, otimize estratégias cirúrgicas e apoie o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos para gliomas da medula espinhal.

Os gliomas da medula espinhal, incluindo os da cauda equina, são comumente neoplasias malignas da medula espinhal, com 20% a 40% classificados como astrocitomas e o restante como ependimomas¹. Com base nas características histológicas, os gliomas da medula espinhal são categorizados em quatro graus (I-IV). Os tumores de grau I e II são considerados gliomas de baixo grau, enquanto os tumores de grau III e IV são classificados como gliomas de alto grau. Embora os gliomas medulares possam ocorrer em qualquer segmento da medula espinhal, eles são mais freqüentemente encontrados na região cervical (33% dos casos) e são relativamente raros em outras regiões, com 26% dos casos na região torácica e 24% na região lombar².

Cirurgia, radioterapia e agentes alquilantes são as principais opções de tratamento para gliomas da medula espinhal, em grande parte extrapolados de ensaios clínicos sobre gliomas cerebrais³. No entanto, pesquisas anteriores demonstraram que, embora os perfis histológicos dos gliomas da medula espinhal se assemelhem aos dos gliomas cerebrais, a presença de assinaturas moleculares distintas os diferencia de seus equivalentes cerebrais⁴. Em nossa coorte, os pacientes com glioma da medula espinhal não obtiveram nenhum benefício significativo da quimioterapia ou radioterapia adjuvante, ressaltando a eficácia limitada dos tratamentos atuais e a necessidade de novas estratégias terapêuticas⁵. Portanto, modelos animais confiáveis e informativos são essenciais para o avanço da pesquisa básica e dos estudos pré-clínicos.

Atualmente, existem vários modelos de glioma medular bem estabelecidos, incluindo o método descrito por Minru et ^al.6. Esses modelos utilizam principalmente técnicas de remoção de vértebras torácicas para expor a medula espinhal ^6,7,8. Embora os modelos de ratos tenham sido empregados no passado, eles estão associados a custos mais altos, tamanhos de amostra menores e maiores desafios de gerenciamento em comparação com os modelos de camundongos. Além disso, mais modelos experimentais de camundongos geneticamente modificados estão disponíveis do que modelos de ratos. Um modelo de camundongo imunocompetente é particularmente valioso para estudar a resposta imune dentro do microambiente do tumor espinhal e para desenvolver estratégias imunoterapêuticas para gliomas da medula espinhal. Além disso, este método é adequado para gerar modelos de xenoenxerto derivados de pacientes para gliomas da medula espinhal.

Este protocolo propõe um procedimento seguro, tecnicamente simples e rapidamente reprodutível para a criação de um modelo de transplante de glioma da medula espinhal em camundongos. Espera-se que o modelo avance na pesquisa sobre os mecanismos amplamente inexplorados subjacentes à progressão do glioma e facilite o desenvolvimento de medicamentos terapêuticos para gliomas da medula espinhal.

Este protocolo foi conduzido em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Ética em Cuidados e Tratamento Animal em Pesquisa Biomédica da Capital Medical University (AEEI-2021-187). Camundongos C57BL/6 fêmeas, com 8 semanas de idade e pesando 19-21 g, foram utilizados neste estudo. Os reagentes e equipamentos utilizados estão detalhados na Tabela de Materiais.

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Limpe e esterilize bem todos os instrumentos cirúrgicos.
2. Pulverize a mesa cirúrgica com álcool e limpe-a com toalhas de papel estéreis.

2. Preparação de células GL261-luc e B16-F10-luc para transplante

NOTA: A linha celular GL261-luc GBM foi obtida comercialmente, enquanto a linha celular de melanoma B16-F10-luc foi um presente do professor Wang Xi. Ambas as linhagens celulares foram confirmadas como livres de infecção por micoplasma por meio de testes pré-experimentais.

1. Prepare o DMEM completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementando-o com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina (100 U / mL) de estreptomicina (100 μg / mL).
2. Cultive células GL261-luc ou B16-F10-luc no meio DMEM completo e colete células durante a fase de crescimento logarítmico para implantação.
3. Lave as células duas vezes com PBS estéril e, em seguida, incube-as com solução de tripsina-EDTA a 0,05% por 3 min.
4. Transferir a suspensão celular resultante para um tubo e centrifugar a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Após centrifugação, descarte o sobrenadante usando uma pipeta, ressuspenda as células em PBS estéril e centrifugue mais uma vez.
6. Pinte as células com azul de tripano e conte as células viáveis usando um contador de células.
7. Preparar a suspensão celular a uma concentração de 5 × 10⁶ células/ml para as células GL261-luc ou 5 × 10⁵ células/ml para as células B16-F10-luc, preparando-a a ser utilizada.

3. Preparação do animal

1. Pesar e anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de uma solução de tribromoetanol a 2,5% (10 μL / g). Confirme a anestesia verificando a perda do reflexo pedal. Todo o procedimento, desde a preparação até a sutura, deve levar aproximadamente 5 a 10 minutos.
   NOTA: Posicione o animal em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante todo o procedimento.
2. Exponha a pele e prepare uma janela cirúrgica limpa (Figura 1A). Raspe o cabelo da região dorsal do pescoço e uma área de 2 cm que se estende bilateralmente a partir da linha média usando uma máquina de cortar cabelo.
   1. Para remover os pelos restantes, aplique uma fina camada de creme depilatório nas áreas depiladas usando um cotonete e deixe agir por 1-2 min. Depois, limpe o creme depilatório com gaze umedecida em sabão.
3. Desinfetar a pele com solução de iodo, aplicada em movimentos circulares por 30 s, seguida de limpeza com álcool 75% para desiodação.

4. Exposição da coluna cervical e determinação do ponto de inserção

1. Posicione os camundongos com o lado dorsal voltado para cima e prenda seus membros à mesa cirúrgica usando fita adesiva. Coloque uma gaze de 1-2 cm de espessura sob a área do pescoço para suporte, proporcionando melhor acesso à medula espinhal.
2. Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 cm ao longo da pele do pescoço usando bisturi cirúrgico e lâmina (Figura 1B). Separe suavemente os músculos do pescoço por dissecção romba, tomando cuidado para evitar ferir os vasos sanguíneos.
3. Disseque cuidadosamente os músculos adjacentes às vértebras cervicais para expor o sétimo processo espinhoso vertebral cervical, um marco ósseo distinto em camundongos (Figura 1C e Figura 1G-I).
4. Limpe qualquer sangue da área cirúrgica usando cotonetes estéreis antes de prosseguir com a injeção.
5. Defina o ponto de punção em 0,5-0,9 mm da linha média da coluna, ajustando a profundidade da injeção para 0,6-0,9 mm com base no peso corporal dos camundongos (16-24 g).
   NOTA: A profundidade de injeção da medula espinhal é de 0,9 mm para camundongos com peso de 22 a 24 g.

5. Injeção de células tumorais

1. Enxágue bem uma seringa de agulha plana de 10 μL com solução estéril de PBS 2-3 vezes.
2. Aspire 2 μL da suspensão celular para dentro da seringa, certificando-se de que não haja bolhas de ar.
3. Estabilize o processo espinhoso vertebral cervical segurando-o e levantando-o suavemente com uma pinça. Use uma agulha chanfrada (1,87 mm de comprimento e 0,48 mm de diâmetro) para perfurar a dura-máter (Figura 1D). Em seguida, mude para uma seringa de agulha plana (0,48 mm de diâmetro) para injetar as células tumorais (Figura 1E).
   NOTA: O local da punção é preservado durante a troca da agulha, com posicionamento preciso confirmado por espasmos dos membros inferiores devido à estimulação nervosa.
4. Injete a suspensão celular lentamente para evitar a interrupção.
5. Mantenha a seringa no lugar por 30 s após a injeção para garantir a implantação bem-sucedida do tumor.

6. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Feche a incisão da pele suturando com uma sutura de náilon 3-0 no final da operação (Figura 1F).
2. Posicione o mouse de lado e coloque-o em um tapete aquecido para manter o calor e garantir uma respiração estável durante a recuperação da anestesia na gaiola.
3. Administre buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea duas vezes ao dia por 3 dias para aliviar a dor.
4. Monitore o mouse para garantir que ele recupere a atividade pré-operatória sem sinais de sangramento ou ruptura da ferida.
   NOTA: A disfunção temporária da medula espinhal, incluindo fraqueza dos membros posteriores, é comum após a cirurgia e geralmente se resolve em 3 horas. Aproximadamente 5% dos camundongos podem desenvolver paralisia, mas geralmente se recuperam em 3 dias. Para esses camundongos, forneça uma dieta nutricionalmente completa e água em gel diretamente no chão da gaiola para garantir acessibilidade adequada. Uma pequena porcentagem (cerca de 5%) dos camundongos que sofrem de paraplegia pode exigir eutanásia.
5. Certifique-se de que os ratos tenham acesso contínuo a água e comida.
   NOTA: Se os animais apresentarem sinais de perda de peso ou paralisia, eles devem ser alojados individualmente.

7. Imagem de bioluminescência in vivo

1. Administrar uma injeção intraperitoneal de 150 mg/kg de D-luciferina dissolvida em D-PBS aos ratinhos.
2. Coloque os camundongos em uma câmara de anestesia contendo isoflurano para indução.
3. Transfira os camundongos para o coletor anestésico integral para manter a anestesia durante o procedimento.
4. Realizar imagens bioluminescentes in vivo conforme descrito no relatório anterior⁹.
   NOTA: O tempo de resposta ideal para D-luciferina em imagens ao vivo de pequenos animais é de 10 minutos após a injeção. Certifique-se de que a imagem seja realizada precisamente 10 minutos após a injeção.

Para estabelecer um modelo animal estável e confiável de glioma espinhal, o espaço intervertebral entre a sexta e a sétima vértebras cervicais em camundongos C57BL/6 foi identificado como o local ideal para inoculação com base na revisão da literatura e em achados experimentais¹⁰. A sétima vértebra cervical fornece um marco ósseo distinto, o processo espinhoso (Figura 1G-I), que ajuda a loc...

O glioma da medula espinhal é o tipo mais comum de tumor maligno primário na medula espinhal, representando mais de 80% dos tumores intramedulares. Patologicamente, os gliomas da medula espinhal são classificados principalmente como ependimomas ou astrocitomas, com foco particular nos astrocitomas¹¹. Entre os astrocitomas, alguns abrigam mutações H3K27M, também conhecidas como gliomas difusos da linha média (DMGs), que estão associados a prognósticos ruin...

Nenhum conflito de interesse foi declarado.

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Geral da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Fundo nº 8207317). Programa de P&D da Comissão Municipal de Educação de Pequim (Fundo No. KZ202210025040). Institutos Chineses de Pesquisa Médica, Pequim (Grant No. CX24PY08).