Estabelecendo um modelo de camundongo para inalação de ar em temperatura extrema de baixa temperatura do trato respiratório

A estimulação ambiental fria tem sido implicada no desenvolvimento de várias doenças crônicas. Portanto, o estabelecimento de modelos animais para pesquisa pré-clínica é crucial. Este sistema atende a essa necessidade oferecendo um dispositivo que cria um modelo de estímulo, atendendo aos requisitos para pesquisa básica sobre mecanismos patogênicos.

Atualmente, a construção de um modelo de camundongo para estimulação ambiental fria emprega placas de calor frio e dispositivos de resfriamento vestíveis. Esses métodos podem atender parcialmente aos requisitos para estudar as respostas e efeitos regulatórios da pele de camundongos ou circuitos neurais à estimulação fria. Numerosos estudos clínicos comprovaram a correlação entre a exposição a ambientes de baixa temperatura e o desenvolvimento de várias doenças. Recentemente, tem havido uma ênfase crescente na troca contínua de informações entre órgãos e tecidos, fornecendo uma nova perspectiva sobre como abordar questões de longa data dentro do corpo humano. No entanto, as instalações existentes não conseguem construir um modelo para camundongos que inalam ar frio.

Embora colocar ratos em um ambiente frio pareça atraente, ele tem limitações consideráveis. Enquanto os camundongos inalam ar frio, sua pele também está sendo estimulada pelo ambiente frio, tornando incerto se as alterações patológicas resultantes são devidas à estimulação pulmonar através da interação de órgãos distantes ou devido aos receptores da pele e à transmissão de sinais neurais. Isso cria uma confusão considerável na pesquisa relacionada. Este esquema apresenta uma nova abordagem para a construção de um modelo de camundongo para estimulação extrema por inalação de ar frio. Este dispositivo permite que os ratos inalem gases de temperatura extremamente baixa enquanto seus corpos permanecem em uma temperatura normal. Ele maximiza a simulação dos efeitos estimulantes de temperaturas ambientes extremas em camundongos e atende às necessidades de pesquisa para estudar a relação entre temperaturas ambientais extremas e doenças relacionadas.

Este método fornece principalmente um modelo de estimulação de ar de temperatura extremamente baixa em camundongos usando um dispositivo de feedback de temperatura de refrigeração de semicondutor não invasivo, padronizado, estável e em lote. Experimentos clínicos relacionados a baixas temperaturas confirmaram uma estreita relação com a incidência e o prognóstico de várias doenças. Um estudo de séries temporais envolvendo 272 grandes cidades da China obteve um total de 1.826.186 casos de mortes não acidentais. A relação entre temperatura e mortalidade indica consistentemente uma curva em forma de J invertido, com a fase de altas taxas de mortalidade devido ao frio sendo significativamente mais longa do que outras temperaturas. Isso sugere que o impacto das baixas temperaturas no AVC e nas doenças cardiovasculares é ilimitado à fase fria; há uma influência contínua durante um período após o desaparecimento da fase fria.

Entre as mortes não acidentais, 14,33% podem ser atribuídas a fatores de temperatura ambiental, sendo que o frio moderado (-1,4 a 22,8 °C) e o frio extremo (-6,4 a -1,4 °C) representaram 10,49% e 1,14%, respectivamente. As causas de morte incluem doenças cardiovasculares e cerebrovasculares em 17,48%, doença coronariana em 18,76%, acidente vascular cerebral isquêmico em 14,09%, acidente vascular cerebral hemorrágico em 18,10%, doenças do sistema respiratório em 10,57% e doença pulmonar obstrutiva crônica em 12,57%¹. Na China, estudos epidemiológicos de AVC sugerem um claro gradiente de norte a sul². No clima gelado do nordeste da China, a prevalência de acidente vascular cerebral é 2,36 vezes maior em comparação com a região sul³. Pesquisas substanciais confirmaram o impacto direto de ambientes de baixa temperatura nas taxas de mortalidade e na incidência de AVC ^4,5,6. Consequentemente, as diferenças significativas de temperatura climática representam um fator ambiental que não pode ser ignorado.

A falta de raciocínio científico eficaz que explique a correlação entre ambientes de baixa temperatura e aumento das taxas de derrame e problemas cardíacos continua sendo um tópico de investigação. Embora a sabedoria convencional sugira que as temperaturas frias podem aumentar a pressão arterial por meio de irritação da pele e excitação simpática⁷, os indivíduos normalmente tomam medidas para se isolar e manter o equilíbrio da temperatura corporal em resposta às condições frias. Quando expostos a temperaturas frias, os humanos modernos confiam em seu sistema respiratório em vez da pele como o principal mecanismo de defesa. Embora roupas grossas possam proteger a pele do frio externo, elas não podem impedir a inalação de ar frio no trato respiratório, expondo a traqueia e os alvéolos a intensa estimulação do frio. Os métodos atuais para a construção de modelos animais para estimulação de baixa temperatura são divididos principalmente em dois aspectos. Primeiro, vários estudos se concentraram em explorar a resposta e os mecanismos regulatórios da pele do camundongo à estimulação de baixa temperatura. Um método envolve colocar camundongos em uma placa que pode controlar as mudanças de temperatura (4-25 ° C) para investigar os mecanismos regulatórios específicos da regulação da temperatura corporal e do comportamento de evitação em resposta a estímulos frios ^8,9. Outros estudos colocaram dispositivos de resfriamento nas costas de camundongos para explorar o papel dos circuitos neurais^{na regulação da} temperatura corporal.

Por outro lado, vários estudos colocaram camundongos em pequenas câmaras com temperaturas variáveis (4-30 °C). A pesquisa de Lal e colegas e Qian et al. usou esse método para construir um modelo de camundongo de estimulação fria para explorar os circuitos neurais que regulam o controle neuroendócrino do comportamento alimentar induzido pelo frio^11,12. No entanto, os dois métodos mencionados têm suas limitações. Primeiro, a temperatura mais baixa é de 4 °C, o que é insuficiente para simular a estimulação do ar em temperatura extremamente baixa. Este método não pode excluir os efeitos reguladores da pele e dos circuitos neurais no ambiente frio. Como local primário de troca de ar, os pulmões também são órgãos onde os neurônios sensíveis ao frio estão concentrados^13,14. O papel regulador dos neurônios sensíveis ao frio em várias doenças também foi confirmado por vários pesquisadores 15,16,17. Como resultado, é urgentemente necessário um método para construir de forma estável, massiva e normativa um modelo animal de baixa temperatura do trato respiratório. Compreender o papel regulador dos pulmões e neurônios sensíveis ao frio em várias doenças crônicas sob estimulação de ar de temperatura extremamente baixa é essencial para fornecer uma base teórica para prevenir e tratar acidente vascular cerebral, doença cardíaca coronária e doenças do sistema respiratório em regiões frias. Nossa equipe abordou essa lacuna crítica construindo um dispositivo de baixa temperatura nos últimos dois anos. Este dispositivo é caracterizado pela repetibilidade, praticidade, estrutura simples e baixo custo, tornando-o adequado para tais estudos.

O Comitê de Ética em Animais Experimentais aprovou todos os procedimentos envolvendo animais no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Harbin.

1. Montagem do dispositivo

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter os componentes do dispositivo.

1. Use conectores de metal para prender dois conjuntos de invólucros de latão a dois conjuntos de chips de resfriamento de semicondutores. Aplique graxa de silicone termicamente condutora entre o invólucro de latão e o chip de resfriamento do semicondutor.
2. Aplique graxa térmica entre o invólucro de latão e o chip de resfriamento do semicondutor.
3. Conecte dois grupos de ventiladores em cada peça de refrigeração de semicondutores abaixo. Certifique-se de que o invólucro de latão, o ventilador, o chip de resfriamento do semicondutor e a graxa de silicone termicamente condutora estejam conectados com segurança como uma unidade completa.
4. Coloque o dispositivo como um todo no frasco coletor de gás e duas placas de cobertura das ranhuras.
5. Instale as placas acima e abaixo do frasco coletor de gás.
6. Conecte o tubo de entrada de água e os tubos de saída de água à entrada e saída de água do invólucro de latão, respectivamente.
7. Conecte quatro grupos de conchas de latão à parte superior e inferior do frasco de coleta de gás com tubos.
8. Conecte a bomba de água ao tubo de entrada de água.
9. Coloque o tubo de saída de água na cisterna.
10. Conecte quatro conjuntos de resfriadores semicondutores e bombas de água a dois conjuntos de fontes de alimentação (12 V e 40 A).

2. Preparação do animal para a experiência

NOTA: Usamos um camundongo macho C57Bl / 6 com 4 semanas de idade para esses experimentos. Recomenda-se que o mouse se adapte ao fixador por 3-5 dias antes da preparação do modelo. O ambiente experimental deve estar à temperatura ambiente e mantido em silêncio para evitar ruídos durante todo o experimento.

1. Prenda o mouse no fixador: Coloque o mouse no fixador, posicionando a parte frontal do nariz do mouse na abertura do fixador. Use um tampão de esponja correspondente para preencher e prender a parte traseira do fixador, garantindo que ele tenha orifícios de ventilação. Em seguida, coloque o fixador do mouse na ranhura cilíndrica do frasco de coleta de gás (Figura 1D).

3. Fluxo de operação experimental

1. Prepare uma mistura de água gelada e coloque-a na cisterna.
   NOTA: Para esta etapa, certifique-se de que o nível de água da mistura de água gelada seja maior do que a bomba para garantir que a mistura seja adicionada a tempo durante todo o experimento. O uso de água em temperatura ambiente não é recomendado
2. Posicione a bomba de água dentro da mistura de água gelada e certifique-se de que a mangueira de saída esteja submersa.
3. Coloque a sonda do sensor de temperatura dentro do orifício de medição de temperatura do frasco de coleta de gás.
4. Conecte a bomba de água à fonte de alimentação e ligue-a.
5. Conecte a fonte de alimentação ao controlador de temperatura, conecte o adaptador de energia da unidade de refrigeração na tomada do controlador de temperatura e defina a faixa de temperatura desejada no controlador.
6. Defina a faixa de temperatura do controlador de temperatura.
7. Após o experimento, remova o mouse e coloque-o de volta em seu ambiente de alojamento.
8. Desligue a fonte de alimentação do controlador de temperatura.
9. Desligue a bomba d'água.

4. Imagens térmicas

NOTA: Para demonstrar e verificar se os camundongos podem inalar ar de temperatura extremamente baixa enquanto mantêm a temperatura corporal normal dentro deste aparelho, a temperatura no frasco de coleta de gás foi medida usando uma câmera termográfica (Figura 2).

1. Use uma câmera termográfica portátil para determinar as temperaturas do orifício de ar e do orifício de medição de temperatura do frasco de coleta de gás a uma distância ideal.
2. Posicione o ponto laser vermelho, indicando o local de medição, precisamente no centro da área de medição de temperatura designada.
3. Empregando a mesma metodologia, meça novamente a temperatura corporal dos camundongos.

Podemos observar a construção geral deste dispositivo, que inclui um chip de refrigeração semicondutor, graxa de silicone termicamente condutora, um frasco de coleta de gás, um controlador de temperatura, um ventilador, um sistema de circulação de resfriamento de água, um fixador de mouse e um adaptador de energia. Uma única unidade pode acomodar simultaneamente as necessidades de modelagem de até 16 camundongos (Figura 1A, B). O frasco de coleta de gás, o sistema de circulação de resfriamento de água, o chip de refrigeração semicondutor, o ventilador e o fixador de mouse constituem o corpo principal do dispositivo (Figura 1C). Dentro do corpo principal do dispositivo, a extremidade frontal do fixador do mouse pode ser inserida no frasco de coleta de gás, garantindo que o nariz do mouse inale diretamente o gás de baixa temperatura (Figura 1D). Quatro conjuntos de ventiladores podem ser observados na parte superior interna do corpo principal do dispositivo, com a parte traseira dos ventiladores conectada ao chip de refrigeração semicondutor por meio de graxa de silicone termicamente condutora (Figura 1E). O fixador do mouse, usado em conjunto com o dispositivo, é cilíndrico, com a extremidade frontal extensível até o frasco de coleta de gás. O fixador possui orifícios de ventilação no meio e um plugue na parte traseira para fixação, atendendo aos requisitos de fixação para mouses de diferentes tamanhos (Figura 1F).

Durante o experimento, uma sonda de sensor de temperatura é normalmente empregada para monitorar continuamente a temperatura dentro do frasco de coleta de gás em tempo real, conforme detalhado na etapa 3.3 do protocolo. Para demonstrar e verificar se os camundongos podem inalar ar de temperatura extremamente baixa enquanto mantêm a temperatura corporal normal dentro deste aparelho, a temperatura no frasco de coleta de gás foi medida usando uma câmera termográfica (Figura 2). A temperatura dentro do frasco de coleta de gás foi observada em aproximadamente -20 ° C. Os resultados indicaram claramente que a temperatura corporal dos camundongos dentro do dispositivo de contenção permaneceu inalterada. Os resultados confirmam que este dispositivo pode permitir que os ratos inalem gases de temperatura extremamente baixa, mantendo a temperatura corporal em um estado normal. Atualmente, vários pesquisadores estão se concentrando no impacto e nos mecanismos patológicos de doenças crônicas em condições extremas de baixa temperatura. Este dispositivo pode atender às necessidades de tal pesquisa. Ao aplicar este dispositivo, um lote estável de modelos animais pode ser construído, estabelecendo uma base sólida para estudos subsequentes.

Figura 1: A estrutura geral do dispositivo e o diagrama de decomposição de cada peça. (A) A exibição geral do dispositivo no estado experimental. (B) A visão ascendente do dispositivo geral indica dois conjuntos de folhas de refrigeração de semicondutores e invólucros de latão na parte inferior do frasco coletor de gás. (C) Imagem parcialmente ampliada do frasco coletor de gás. (D) Depois de remover a imagem ampliada localmente do dispositivo superior do tanque, pode-se observar que a extremidade da cabeça do fixador de mouse pode ser estendida para dentro do frasco durante o experimento, garantindo que apenas o nariz do mouse seja exposto ao ambiente de baixa temperatura. (E) Imagem ampliada do ventilador. (F) A imagem do dispositivo de fixação do mouse indica a extremidade da cabeça do dispositivo, o orifício de ventilação e o plugue de cola na cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O diagrama de monitoramento do efeito de resfriamento durante a operação do dispositivo. (A) Sob o monitoramento de um termômetro de infravermelho distante, todo o dispositivo pode ser observado em um estado de baixa temperatura. O material de isolamento fixado ao exterior do dispositivo indica uma temperatura de 13 °C. (B) Usando um termômetro de infravermelho distante para medir a temperatura da porta de ventilação onde o suporte do mouse é colocado durante o experimento, pode-se observar que a temperatura dentro do recipiente de coleta de gás é de -21,1 °C. O dispositivo atendeu aos nossos requisitos de design. (C) No experimento, os camundongos foram retirados do dispositivo e o termômetro infravermelho distante foi usado para medir a temperatura do nariz e do corpo dos camundongos. Os resultados demonstraram que a temperatura do nariz dos camundongos era significativamente mais baixa, enquanto a temperatura do corpo permanecia normal. (D) Um orifício de medição de temperatura é projetado na parte superior do dispositivo experimental. Um termômetro de infravermelho distante foi usado para medir a temperatura dentro do frasco coletor de gás através do orifício de medição de temperatura, indicando que a temperatura interna do frasco coletor de gás é de -21 °C, o que prova que o dispositivo pode ser usado para estudos de temperatura fria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na construção de um modelo de estimulação de baixa temperatura, várias etapas e precauções importantes são necessárias para garantir a precisão do experimento e o bem-estar dos animais. Use uma mistura de água gelada em vez de água em temperatura ambiente para manter um estado de baixa temperatura da água de resfriamento durante todo o experimento, o que ajuda a simular ambientes de temperatura extremamente baixa. Certifique-se de que o sistema de recirculação de água de resfriamento esteja desobstruído para garantir a operação eficiente do sistema de refrigeração. Ao preparar uma mistura de água gelada, considere os seguintes pontos: (1) Uma mistura de água gelada significa gelo sólido por baixo e água por cima do gelo sólido; (2) Observe cuidadosamente o processo de derretimento do gelo sólido durante o experimento, pois isso pode fazer com que o gelo flutue. Esse gelo flutuante pode obstruir a superfície da bomba, dificultando assim a dissipação de calor eficaz. No final do experimento, desligue a fonte de alimentação da unidade de refrigeração antes da bomba d'água. Isso garante que o sistema de recirculação de água possa continuar dissipando o calor do semicondutor de refrigeração após o desligamento, evitando aumentos repentinos de temperatura que podem afetar os resultados. Para monitoramento de temperatura, este dispositivo usa um controlador de temperatura inteligente. A fonte de alimentação do dispositivo é conectada ao controlador de temperatura inteligente e o controlador é usado para definir a faixa de temperatura. Durante o experimento, a sonda de temperatura é colocada no frasco coletor de gás para monitorar continuamente a mudança de temperatura. Quando a temperatura excede a faixa definida, o controlador desconecta automaticamente a fonte de alimentação do dispositivo para manter a temperatura dentro da faixa definida.

Se a eficiência da refrigeração for significativamente reduzida ou o dispositivo de refrigeração falhar durante o experimento, considere as seguintes possibilidades: (1) Certifique-se de que a bomba esteja na mistura de água gelada; (2) verifique se a temperatura da água está extremamente alta; (3) inspecionar a folha de refrigeração de semicondutores quanto a danos; (4) Verifique se a linha de conexão de energia da folha de refrigeração do semicondutor está quebrada.

Este dispositivo tem limitações. Durante o experimento, uma grande quantidade de mistura de água gelada é necessária para resfriar a folha de refrigeração do semicondutor, e a eficiência de resfriamento do dispositivo é afetada pela eficiência de resfriamento do chip de resfriamento do semicondutor. Melhorias futuras podem incluir o projeto do dispositivo de refrigeração do ciclo da água como um dispositivo de circuito fechado e o uso de líquido de refrigeração ou anticongelante como meio de resfriamento. Simultaneamente, otimizar a aparência do equipamento e lidar com o vazamento nu de tubulações e linhas de conexão de energia aumentará a conveniência de transportar e popularizar o dispositivo. Além disso, para manter uma inalação consistente e estável de gás de baixa temperatura pelos camundongos, um dispositivo de fixação de camundongo e uma rolha de borracha foram empregados para imobilizar os camundongos. Devido à inalação de gás extremamente frio, o processo de estimulação foi limitado em duração para salvaguardar o bem-estar dos camundongos e evitar queimaduras e problemas psicológicos. Esforços futuros se concentrarão em melhorar o acessório para minimizar danos adicionais durante a fase de estimulação em camundongos.

Essa tecnologia não é apenas significativa para a pesquisa científica básica sobre os efeitos de ambientes de baixa temperatura em organismos biológicos, mas também tem aplicações potenciais no estudo da patogênese de doenças crônicas em populações que vivem em regiões frias. A definição de ar extremamente frio varia entre diferentes regiões e ambientes. No entanto, ao configurar o sistema de controle de temperatura, o dispositivo pode ser ajustado para atender aos requisitos de pesquisa para qualquer temperatura que varie da temperatura ambiente a -20 °C. Essa flexibilidade garante que o dispositivo possa acomodar as diversas necessidades de temperatura dos pesquisadores. Além disso, contribui para explorar o papel dos pulmões na comunicação entre órgãos em condições de baixa temperatura, fornecendo uma base sólida para prevenir e tratar derrames, doenças cardíacas coronárias e doenças do sistema respiratório em regiões frias. Seguindo essas etapas e precauções, os pesquisadores podem construir um modelo animal estável e padronizado para estudar os efeitos de ambientes de temperatura extremamente baixa em organismos biológicos, fornecendo uma base científica para prevenir e tratar doenças relacionadas.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Nenhum