본 연구는 세포간 감염 모델을 확립하기 위해 황색포도상구균 감염에 초점을 맞추고 있습니다. 이 모델은 세포 간 감염의 기저에 있는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 예방 및 치료를 위한 엄격한 연령 개발에 기여할 것입니다. 황색포도상구균 세포 내 감염의 최신 진전은 세포 내 박테리아의 생존 및 확산을 조절하기 위한 감염 메커니즘을 연구하는 것이며, 더 많은 치료 효과를 향상시키기 위해 약물 및 구조 변형을 최적화하는 데 추가될 것입니다.
이 연구 분야는 세포 배양, 세포 출현 염기서열 분석 기술, 고연료 산소 열, 유전자 편집 기술 및 기타 관련 기술을 사용하여 세포 내 박테리아 감염을 연구합니다. 전통적인 감염 모델과는 대조적으로, 우리는 세포 내 감염에 특이적인 실험 조건을 개선했습니다. 세포를 황색포도상구균으로 개별적으로 감염시킨 후, 박테리아에 감염된 세포를 쥐에 접종하여 세포 내 감염을 일으킵니다.
이 접근 방식은 자유 박테리아의 간섭을 최소화하여 효율성을 향상시켜 세포 내 감염 과정을 보다 정확하게 보존할 수 있습니다. 앞으로도 항체 치료제 개발에 주력하여 세균 감염의 예방 및 치료를 위해 나아갈 것입니다. 6% 전분 육수를 준비하려면 쇠고기 추출물 분말, 트립톤, 염화나트륨을 유리 용기에 3 대 10 대 5의 질량 비율로 연속적으로 첨가합니다.
이중 증류수 100ml를 넣고 저어 성분을 녹입니다. 전자 레인지에서 용액을 가열하십시오. 그런 다음 용해성 전분을 6의 질량비로 첨가하고 완전히 용해될 때까지 혼합물을 저어줍니다.
육수를 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 멸균이 완료되면 페이스트가 될 때까지 육수를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 쥐 복막 대식 세포를 수집하려면 왼손을 사용하여 마우스의 목을 잡고 꼬리를 제어하십시오.
그런 다음 머리가 아래쪽을 향하고 복부가 위를 향하도록 마우스를 뒤집습니다. 6%의 전분 육수를 마우스에 3ml의 복강내 주사합니다. 72시간 주사 후 마취된 마우스를 희생하고 75% 에틸 알코올로 소독합니다.
안과 가위를 사용하여 마우스의 복부를 잘라 복막이 완전히 보이도록 합니다. 복강내 주사를 통해 10ml의 DMEM을 복강에 주입합니다. 1분 동안 복부를 부드럽게 문질러 충치를 세척합니다.
그런 다음 주사기를 사용하여 세척된 유체를 50ml 원심분리기 튜브에 모읍니다. 세척액을 300G에서 5분간 원심분리하고 상등액을 버립니다. 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 10ml의 DMEM에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
10마이크로리터의 세포 현탁액을 세포 계수기에 첨가하여 세포를 계수합니다. DMEM FBS를 사용하여 세포를 2 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 6 세포의 거듭제곱으로 희석합니다. 웰당 1밀리리터의 세포 현탁액을 6웰 플레이트에 플레이트합니다.
섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 함유한 플레이트를 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 상층액을 제거하십시오. 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척하고 동일한 조건에서 웰당 1ml의 DMEM으로 하룻밤 동안 배양합니다.
복막 대식세포를 황색포도상구균 MRSA-252로 2시간 동안 배양합니다. 상등액을 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 100마이크로그램/밀리리터 겐타마이신을 함유한 완전한 DMEM 배지를 웰당 1밀리리터씩 첨가하고 5%의 이산화탄소를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
배양 후 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 복막 대식세포를 50ml 원심분리 튜브에 모읍니다. 1000G에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
세포 내 MRSA-252에 감염된 대식세포에 라이소자임 1밀리리터당 10마이크로그램을 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후 PBS 1ml에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 약 20마이크로리터의 분취액을 꺼내고 0.1%트리톤 X-100을 5분 동안 첨가하여 세포를 용해시킵니다.
PBS로 용해된 세포 현탁액을 연속 희석하고 트립틱 소두 오거 플레이트에 떨어뜨립니다. 섭씨 37도에서 밤새 접시를 배양합니다. 다음 날, 복막 대식세포의 세포 내 MRSA-252 박테리아를 계산하기 위해 박테리아 군집을 세십시오.
꼬리 정맥이 확장될 때까지 마우스를 적외선 물리 치료 lamp . 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나눕니다. 정맥 주사로 3 번 10 6 CFU 플랑크톤 MRSA-252를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다.
24시간 후 마취된 마우스를 제물로 바치고 75% 에틸 알코올로 철저히 소독합니다. 한 손으로는 핀셋을 사용하여 복부 피부를 들어 올리고 다른 손으로는 안과 가위로 피부를 자릅니다. 복강에서 신장을 찾아 조심스럽게 완전히 벗겨냅니다.
PBS 1ml가 들어 있는 분쇄관에 신장을 옮기고 고체 조직이 남지 않을 때까지 갈아줍니다. 균질화된 조직을 Eppendorf tube에 붓습니다. PBS를 사용하여 조직 균질화의 연속 희석을 수행합니다.
각 희석액을 별도의 삼부작 소이 오거 플레이트에 놓고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 박테리아 군집의 수를 세고 데이터를 분석합니다. S.aureus의 세포 내 감염 모델은 최적화된 식균 작용 조건과 확장된 항생제 처리 하에서 성공적으로 확립되었으며, 일부 박테리아는 대식세포 내에서 생존했습니다.
메티실린 내성 사우레우스(S.aureus)에 감염된 대식세포는 상층액에 더 이상 박테리아가 포함되어 있지 않자 항생제 처리 2시간 후에도 세포 내 박테리아를 유지했습니다. 생체 내에서 마우스의 박테리아 집락화 분석은 반코마이신이 세포외 S.aureus를 제거했지만 세포 내 박테리아를 제거하지 못했다는 것을 보여주었습니다.
