High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-derived Xenografts(유방암 환자 유래 이종이식편의 High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of breast Cancer Patient-derived Xenografts)

제 연구실의 연구는 유방암 환자의 근육 피로를 촉진하는 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 구체적으로 말하자면, 유방 조직에 국한된 종양과 말초 골격근 사이의 소통을 이해하고, 그 근육 내에서 피로를 유발하는 분자 반응을 이해하고자 합니다. 3D 세포 배양 모델의 개발은 통제된 조건에서 근육 피로와 같은 기능적 반응을 연구할 수 있는 고처리량 연구를 가능하게 합니다.

기능성 세포 배양 실험은 병렬로 수행할 수 있으며 동등한 동물 모델보다 시간이 덜 소요되어 신속한 발견과 혁신을 촉진합니다. 전통적인 환자 유래 이종이식 모델을 사용하여 관련 기능적 표현형을 평가하는 것은 시간과 자원이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 PDX를 마우스에 동시에 주입할 수 있도록 하여 연구원들이 강력한 동물 실험을 사용하여 인간 종양에 대한 전신 반응을 연구할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜은 기존 방법보다 개선된 규모로 환자 유래 유방 종양 세포의 정소성 주입을 가능하게 하여 단일 연구원이 하루에 최대 수십 마리의 마우스를 빠르게 주입할 수 있도록 합니다. 또한, 종양의 해리는 동물 간에 세포 유형을 고르게 분포시키는 균질한 세포 현탁액을 생성합니다. 제 실험실의 데이터에 따르면 PDX 마우스와 인간 암 환자에서 유방암에 대한 유사한 근육 분자 반응이 확인되었습니다.

따라서 우리는 이 전임상 마우스 모델을 활용하여 후보 약물을 스크리닝하고 유방암 환자의 피로를 완화할 수 있는 잠재력이 있는 치료법을 식별하고자 합니다. 먼저 인간 종양 해리 키트에서 효소 H, R 및 A를 해동합니다. 멸균 튜브 C에 200마이크로리터의 효소 H, 100마이크로리터의 효소 R 및 25마이크로리터의 효소 A를 추가합니다.C 튜브에 4.7ml의 멸균 RPMI 1640 배지를 추가하여 최종 부피를 약 5ml로 조정합니다.

그런 다음 해동된 종양 조각과 함께 제공되는 동결 매체를 멸균된 100mm 배양 접시의 절반에 옮깁니다. 멸균 겸자를 사용하여 종양 조각을 멸균 5ml 마이크로 튜브로 옮기고 1-3ml의 멸균 PBS로 세척합니다. 멸균 집게를 사용하여 소독된 조각을 새 5mm 마이크로 튜브로 옮깁니다.

멸균 PBS로 두 번째 세척 후 조각을 100mm 배양 접시의 마른 절반으로 옮깁니다. 두 개의 멸균 번호 10 메스 날을 사용하여 종양 조직을 철저히 다집니다. 다진 종양 조각을 한쪽 블레이드로 옮기고 준비된 효소 용액이 들어 있는 C 튜브에 넣습니다.

C 튜브를 여러 번 뒤집어 효소 용액 내에서 종양 조각이 균일하게 분포되도록 합니다. 이제 C 튜브를 기계 해리기에 놓고 튜브를 뒤집어 모든 내용물이 매체에 잠기도록 합니다. 터치스크린 인터페이스에서 37CHTDK3 프로그램을 선택합니다.

해리 프로그램이 완료되면 튜브 내용물을 검사합니다. 적절한 해리가 이루어지면 200G에서 C 튜브를 섭씨 4도에서 5-8분 동안 원심분리합니다. 진공 흡입 또는 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 RPMI 1640의 셀 펠릿을 원하는 최종 주입 부피의 절반에 해당하는 부피로 다시 현탁시킵니다.

2밀리리터 둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에 RPMI의 원하는 양의 희석된 세포 현탁액과 동일한 부피의 Matrigel을 결합합니다. 균질성을 보장하기 위해 반복적인 피펫팅으로 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 먼저 인간 유방 종양을 단세포 현탁액으로 해리합니다.

그런 다음 바늘이 부착되지 않은 1ml 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 흡인하여 균질성을 보장합니다. 주사기에 26게이지 바늘을 부착하고 원하는 주입량을 빼냅니다. 그런 다음 주사기를 부드럽게 두드리거나 튕겨 기포를 제거합니다.

마우스의 대상 주사 부위에 제모 크림을 얇게 바르십시오. 주입 부위를 청소한 후 등쪽 피부의 목덜미와 등을 단단히 잡고 마우스를 단단히 구속하고 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 바늘 길이를 조절하여 엉덩이 쪽을 향해 45도 각도로 바늘을 삽입하고 뚱뚱한 패드에서 꼬리 방향으로 약 0.5-1cm 정도 바늘을 삽입합니다.

바늘을 지방 패드로 전진시키고 통제된 방식으로 원하는 양의 세포 현탁액을 주입합니다. 주입 후 바늘을 180도 회전하고 잠시 위치를 유지한 후 천천히 빼내면 주입 부위의 세포 손실을 최소화할 수 있습니다.