In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

본 연구의 범위는 간 기관 형성 분야입니다. 우리가 대답하려고 하는 질문은 어떻게 간이 그렇게 커지고 줄기세포에서 간 조직을 만들기 위한 리버스 엔지니어링 접근 방식에 사용되는지입니다. 우리 간 재생 의학 분야에서 가장 최근의 발전은 소형화 분야입니다.

우리는 줄기세포를 사용하여 실제 장기를 복제하는 소형 조직을 만들고 있으며, 이를 통해 장기 형성과 장기 생물학을 연구할 수 있습니다. 우리 연구실은 간 재생 의학 분야에서 몇 가지 중요한 발견을 가지고 있습니다. 이러한 소형화 기술 중 일부를 사용하여 우리는 형태 형성 및 세포 이동을 포함하여 간 장기 형성 중 주요 단계를 식별했습니다.

이것이 이 분야에서 우리가 발견한 주요 발견 중 하나입니다. 이 출판물에 있는 프로토콜의 장점은 소형화 중에 여러 가지 다른 오가노이드 기술을 가능하게 한다는 것입니다. 따라서 본질적으로 우리는 이제 다른 어떤 기술도 제공할 수 없는 소형 간 조직에서 분기, 형태 형성 및 이동의 다른 측면과 같은 과정을 연구할 수 있습니다.

지금까지 우리가 해온 연구로 인해 앞으로 우리가 묻게 될 연구 질문은 세포의 성장과 이동이 어떻게 조율되는지에 관한 것입니다. 또한 조직을 간과 유사한 더 큰 조직으로 조립할 수 있는 메커니즘에 대해 질문할 것입니다. 우선, 5%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 T75 플라스크에서 인간 간모세포종 HepG2 야생형 세포를 배양하고 배지를 매일 바꿉니다.

80%농도에 도달하면 PBS로 세포를 헹굽니다. PBS를 버린 후 0.05%의 트립신 EDTA 5ml로 세포를 배양합니다. 그런 다음 동일한 양의 cDMEM을 첨가하여 플라스크에서 세포를 씻어냅니다.

세포가 분리되면 혼합물을 15ml 멸균 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300G의 세포 현탁액을 원심분리합니다. cDMEM에서 세포를 재현탁한 후 세포를 계수하여 밀리리터당 세포의 최종 농도를 결정합니다. 세포에 라벨을 붙이려면 15ml 원뿔형 튜브에서 300G에서 5분 동안 회전시킵니다.

펠릿을 무혈청 성장 배지에 재현탁시켜 10의 1배의 최종 농도를 1밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱으로 달성하고, 회전 시 세포 현탁액 1밀리리터당 5마이크로리터의 형광 세포 표지 용액으로 펠릿을 배양합니다. 다음으로, 450G에서 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 새로운 cDMEM에 재현탁합니다. 스페로이드 형성을 위해 세포 현탁액을 혼합하고 100마이크로리터의 세포 현탁액을 아가로스로 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

플레이트를 340G에서 10분 동안 원심분리하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 5일에서 9일 동안 배양합니다. 간 스페로이드는 크기에 관계없이 5일째까지 완전히 압축되어 두꺼워짐에 따라 반투명에서 불투명으로 변했습니다. 시작하려면 96웰 플레이트에서 간 및 중간엽 스페로이드를 얻습니다.

피펫을 사용하여 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF MRC-5 스페로이드를 새로운 cDMEM이 들어 있는 15ml 멸균 원추형 원심분리 튜브에 개별적으로 수집합니다. 얼음 위에서 스페로이드를 5분 동안 배양하여 가라앉힌 다음 따뜻한 cDMEM으로 부드럽게 헹굽니다. 피펫을 사용하여 단일 HFF MRC-5 스페로이드를 인간 간모세포종 G2 야생형 스페로이드가 들어 있는 웰로 부드럽게 옮깁니다.

얼음처럼 차가운 성장 인자 감소된 Matrigel로 스페로이드를 1:1 희석하여 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 75마이크로리터의 신선한 cDMEM을 추가하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 2-3일 동안 배양합니다. 형광 현미경 검사 및 이미지 분석을 통해 약간의 형태학적 차이가 관찰되었지만 다양한 매트릭스와 매체에서 집합체 형성이 성공적으로 이루어졌음을 확인했습니다.

추가 분석을 통해 스페로이드가 더 가까울수록 다짐 시간이 더 빨라지는 것으로 나타났습니다. 시작하려면 인간 간모세포종 G2 야생형 세포에서 간 스페로이드를 얻습니다. 스페로이드를 15ml 멸균 원뿔형 원심분리기에 개별적으로 모으고 튜브를 얼음 위에 올려 스페로이드가 가라앉도록 합니다.

그런 다음 튜브에서 매체를 조심스럽게 흡입합니다. 별도의 15ml 멸균 튜브에 1ml의 저온 성장 인자 감소 마트리겔 또는 GFR MG와 저온 대조 성장 배지를 1:1 희석으로 혼합합니다. 스페로이드가 들어 있는 튜브에 혼합물을 추가하여 균일한 스페로이드 분포를 보장합니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 MG 용액에 15마이크로리터의 단일 스페로이드를 수집하고 60mm 페트리 접시에 천천히 심습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 물방울을 60분 동안 배양하고 원하는 성장 배지 5ml를 페트리 접시에 천천히 추가합니다. 헵 스페로이드는 9일째까지 섬유아세포 클러스터를 향해 돌출된 두꺼운 이동 가닥을 발달시켰습니다.

먼저 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF MRC-5 세포를 수확하여 제곱센티미터당 5,000개 세포의 밀도로 T75 조직 배양 처리 플라스크에 파종합니다. 섭씨 37도에서 15ml의 cDMEM에 5% 이산화탄소를 넣고 72시간 동안 플라스크를 배양합니다. 다음으로, 중간엽 컨디셔닝 배지(M-CM)를 15ml 멸균 원뿔형 튜브에 넣고 290G에서 5분 동안 원심분리하여 파편을 제거합니다.

살균을 위해 0.2마이크로미터 필터로 상층액을 여과하고 여과액을 유지합니다. 그런 다음 원하는 실험을 위해 최대 1:7 희석 비율로 M-CM을 완전한 성장 배지로 희석합니다. HFF MRC-5 세포를 새로운 cDMEM에 현탁시켜 10의 6배, 10의 5개 세포의 최종 농도를 달성하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

세포 현탁액과 얼음-저온 성장 인자 감소 Matrigel 또는 쥐 꼬리 콜라겐을 1:1 희석으로 혼합합니다. 100마이크로리터의 HFF MRC-5 및 Matrigel 용액을 간 스페로이드가 함유된 웰에 옮기고 5% 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막으로, 각 웰에 75마이크로리터의 새로운 cDMEM을 추가하고 최대 12일 동안 배양합니다.

집단 이동은 M-CM을 이용한 간 스페로이드의 액적 형성을 사용하여 시험관 내에서 효과적으로 유도되었습니다. M-CM의 농도 의존적 효과는 세포 가닥의 출현과 스페로이드로부터의 분지를 촉진했습니다. 11일째가 되자 스페로이드의 세포 돌출부가 더욱 뚜렷해져서 상호 연결된 시트를 형성했습니다.