우리는 인간 교모세포종의 주요 특징을 요약하는 종양을 생성하는 면역 능력이 있는 마우스 뇌에 GEM 유래 교모세포종 세포를 두개내 주입하는 최적의 기술을 설명합니다. GEM 유래 TRP 세포의 동소 주입을 위한 이 기술은 피질에서 발생하지만 GEM 종양의 침습성을 유지하는 종양에 대해 재현성이 높고 확장 가능하며 일관된 결과를 제공합니다. 마우스 교모세포종 뇌종양은 공격적인 성장을 나타내고 주변 뇌 실질을 침범합니다.
따라서 환자의 종양 침윤 및 이동을 억제할 수 있는 치료제를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 뇌종양 모델, 바이러스, 치료제에 맞게 맞춤화하거나 정위 좌표를 조정하여 다른 뇌 영역에 주입하도록 조정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Devon Atkinson이 될 것입니다.
시작하려면 표면 보호기를 정체 장치 아래와 작업 표면에 놓으십시오. 마취 기계의 비닐 튜브를 정위 장치의 가스 마취 플랫폼의 포트 내에 연결하고 다른 튜브를 외부 포트에 연결합니다. 디지털 디스플레이를 전원과 장치에 연결합니다.
다음으로 마이크로 펌프 컨트롤러를 전원에 연결한 후 마이크로 펌프를 장치의 매니퓰레이터 암에 부착합니다. 마이크로 펌프를 초당 5.6나노리터로 설정합니다. 마우스 가열 패드를 온도 컨트롤러와 전원에 연결합니다.
기포를 피하여 메틸 메틸셀룰로오스 셀 혼합물로 30게이지 정밀 주사기를 역로드합니다. 플런저를 삽입한 후 바늘을 부착하고 로드된 셀 혼합물이 바늘을 통해 떨어질 때까지 플런저를 누릅니다. 70% 알코올 준비 패드로 바늘을 청소하십시오.
정밀 주사기가 마이크로 펌프에 부착되면 매니퓰레이터 암을 스테이지에서 멀리 돌려 주사기 바늘 변위를 방지하기 위해 마우스를 놓기 전에. 마취된 마우스를 정위 기구로 옮기고 위 치아를 노즈 콘 지지대에 올려 코 콘에 고정합니다. 노즈콘을 손잡이로 조인 후 발가락을 꼬집어 반사 신경을 확인하여 적절한 마취를 확인하십시오.
그런 다음 이어바를 삽입하고 손잡이를 조여 헤드를 고정합니다. 마취 상태에서 눈을 윤활하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 부프레노르핀 SR 진통제를 피하 주사하고 직장 마우스 프로브를 배치하여 내부 온도를 모니터링합니다.
바깥 쪽 원을 사용하여 수술 부위를 소독하고 수술 용 스크럽과 에탄올을 세 번 번갈아 가며 소독합니다. 팽팽한 피부를 집게로 당기고 메스 칼날을 사용하여 눈 사이를 약 1cm 길이로 절개합니다. 세포 주입의 경우 마우스에 부착된 주사기로 매니퓰레이터 암을 반환합니다.
손잡이를 조인 후 수평면의 X 및 Y 손잡이를 사용하여 주사기를 움직여 브레그마 위에 장착합니다. Z 노브를 사용하여 바늘을 내려 브레그마 위치를 확인하고 디지털 판독 콘솔을 0으로 설정합니다. 그런 다음 X 및 Y 노브와 해당 디지털 판독 값을 사용하여 원고에 설명 된대로 바늘을 원하는 위치로 이동하고 Z 노브를 사용하여 바늘을 두개골 표면으로 이동합니다.
1게이지 바늘이 부착된 25밀리리터 주사기를 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다. 매니퓰레이터 암을 옆으로 조심스럽게 돌리면서 바늘의 경사를 30게이지 정밀 주사기 쪽으로 놓습니다. 장전된 정밀 주사기 바늘이 있는 매니퓰레이터 암이 구멍 위에 위치하면 바늘 끝을 구멍에 맞추고 Z 손잡이를 사용하여 바늘을 뇌의 경막으로 내립니다.
디지털 판독 콘솔을 0으로 설정한 후 Z 노브로 바늘을 1mm 내리고 1분 동안 기다립니다. 2mm 깊이에 도달하면 마이크로 펌프를 중지하고 2마이크로리터의 셀 현탁액이 주입되면 펌프가 멈추는지 확인합니다. 두개골에서 바늘을 제거하려면 1 밀리미터를 올리고 1 분 정도 기다리십시오.
상처 봉합을 위해 끝이 솜으로 된 어플리케이터의 나무 끝을 사용하여 뼈 왁스 조각을 원뿔 모양으로 만듭니다. 왁스를 두개골의 구멍에 넣은 후 구멍에 밀어 넣습니다. 구슬 멸균 집게를 사용하여 두개골에 남아 있는 왁스를 녹입니다.
부드러워지면 마취 부피바카인 용액 2방울을 절개 부위에 넣고 집게를 사용하여 피부 가장자리를 함께 당깁니다. 하나 또는 두 개의 상처 클립을 사용하여 피부를 팽팽하게 당긴 후 피부를 닫고 통풍이없는 영역의 가열 패드에있는 깨끗한 회복 케이지에 마우스를 넣고 마우스를 면밀히 관찰하십시오. 주간 MRI 스캔은 뇌 내 종양 부담 증가와 종양 부피 측정을 보여주었습니다.
MRI 종양 부피 측정 결과 방사선 치료 후에도 종양 성장 억제가 부족한 것으로 나타났으며, 처리된 마우스의 생존율은 증가하지 않았다. syngeneic 모델의 GBM 종양은 공격적으로 성장한 것으로 보였고 말단 종점에 의해 두개골을 침범했습니다. 세포 이식 후 영상에서 두개외 성장이 관찰되면 주사 과정에서 세포 누출을 나타내며 주사 바늘을 빼는 동안 더 많은 주의를 기울여야 합니다.
동소 TRP GBM 종양의 조직병리학은 가성고화증 및 괴사와 같은 종양의 독특한 특징의 요약을 포함하여 4등급 성상세포종의 존재를 확인했습니다. 브레그마에서 영점을 설정할 때 정확한 세포 주입 좌표를 보장해야 합니다. 뇌의 바늘을 낮추고 올리는 것은 외상과 역류를 방지하기 위해 느려야 합니다.
종양 세포 주입 후 매주 MRI 스캔을 사용하여 치료를 시작하기 전에 기준선 종양 크기를 결정하고 뇌 내 변화하는 종양 부담을 시각화할 수 있습니다.
