이 프로토콜은 키나아제 분자 크기 인산화를 직접 평가하여 KCC2 조절과 관련된 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있으므로 생리적 기능과 활성을 밝힐 수 있습니다. 단백질 발현이 매우 미세한 경우에도 관련 분자의 복잡한 혼합물에서 관심 단백질과 같은 분자를 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 복잡한 시스템의 단백질 분석 및 비정상적인 조직 기능 또는 질병의 기저에 있는 잠재적 메커니즘을 식별하는 데 필수적인 도구입니다.
절차를 시연하는 것은 일요일 솔로몬 요시야, 내 실험실의 박사 과정 학생입니다. 섭씨 37도의 비드 배스에서 모든 시약을 미리 무장시키고 안정적으로 형질전환된 래트 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포를 비드 배스에서 완전히 해동하는 것으로 시작한다. 그런 다음 세포를 냉동 바이알 튜브에서 5 밀리리터의 신선한 배지가 들어있는 원심 분리 튜브로 옮기고 세포를 1, 200G에서 3-5 분 동안 원심 분리합니다.
진공 펌프에 고정된 흡인기 피펫을 사용하여 상청액을 흡인시킨 후, 세포를 10밀리리터의 새로운 배지에 재현탁시킨다. 현탁액을 10cm 접시에 옮기고 섭씨 37도의 온도와 5%이산화탄소의 인큐베이터에서 48시간 동안 자라도록 합니다. 세포가 90 % 컨플루언스에 도달하면 오래된 배지를 흡인하고 2 밀리리터의 PBS로 헹구어 분리합니다.
2 밀리리터의 트립신을 넣고 실온에서 약 1-2 분 동안 배양하십시오. 트립신 세포를 2 밀리리터의 전체 배지를 사용하여 세척하십시오. 새로운 요리에 9 밀리리터의 신선한 미디어를 추가하십시오.
그런 다음 이전 접시에서 새 접시에 1 밀리리터의 용액을 추가하십시오. 분할 셀 접시를 인큐베이터로 48시간 동안 옮겨 90% 이상의 컨플루언스를 얻습니다. 용해 완충액에서 수확하기 전에 세포를 디메틸 설폭사이드, 8 마이크로몰 스타우로스포린 또는 0.5밀리몰 N-에틸말레이미드로 15분 동안 처리합니다.
형질전환된 배양 접시로부터 배지를 흡인하고, 배양 접시를 얼음 위에 놓고, 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척한다. PBS를 흡인하고 접시에 얼음 냉장 용해 완충액 1.0ml를 추가합니다. 차가운 플라스틱 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어 낸 후 세포 현탁액을 얼음 위에 놓인 미세 원심 분리 튜브로 옮긴 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 계속 교반합니다.
차가운 원심 분리기에서 세포 용해물을 원심 분리 한 후 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 미리 냉각된 신선한 튜브에 모으고 펠릿을 버립니다. 피펫 300 마이크로리터의 단백질 G 세파로즈를 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다.
그런 다음 500G에서 2 분 동안 용액을 원심 분리합니다. 상청액을 버린 후 500 마이크로 리터의 PBS를 넣고 잘 와동하십시오. 원심분리 후 상층액을 버리고 상기 단계를 반복한다.
다음으로, 1 밀리그램의 항 -KCC2 트레오닌 906 및 항 -KCC2 트레오닌 1007 항체를 200 마이크로 리터의 단백질 G 세파 로스 비드와 혼합하고 PBS로 부피를 500 마이크로 리터로 구성한다. 진동 플랫폼이나 회전 휠에서 섭씨 4도에서 2 시간 동안 흔든 후 PBS로 두 번 세척을 반복하십시오. 세포 용해물에 대한 단백질 정량화를 수행하고 세척된 비드에 세포 용해물 1mg을 추가하고 스핀다운하기 전에 종단 간 회전 장치에서 배양합니다.
150 밀리몰 염화나트륨을 함유하는 PBS로 세 번 세척한 다음, 100 마이크로리터의 LDS 샘플 완충액에 최종 펠릿을 재현탁하기 전에 200 마이크로리터의 PBS로 세 번 세척합니다. 실온에서 로터 셰이커의 튜브를 5 분 동안 흔 듭니다. 겔 로딩을 위해 상청액을 사용하기 전에 가열 블록에서 배양하고 원심 분리하십시오.
웨스턴 블롯 주조 장치를 조립하고 새로 준비된 8%분리 젤을 부어 겔을 주조하여 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 확보합니다. 200마이크로리터의 절대 이소프로판올을 설정에 추가하고 실온에서 60분 동안 그대로 둡니다. 피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200 마이크로 리터의 증류수로 겔을 조심스럽게 헹굽니다.
새로 준비한 6% 스태킹 젤을 캐스팅 설정에 추가한 후 웰 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30분 동안 방치합니다. 그런 다음 주조 된 젤을 전기 영동 탱크에 고정하십시오. 실행 버퍼를 탱크에 부은 후 5 마이크로 리터의 분자량 마커를 첫 번째 웰에 넣고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 젤의 각 웰에 넣습니다.
빈 우물을 LDS로 채우고 120 볼트에서 약 90-120 분 동안 젤을 실행하십시오. 니트로셀룰로오스 막을 20%메탄올을 함유한 전달 완충액으로 재수화시킨다. 전달 버퍼로 젤과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펼칩니다.
이 순서로 이송 할 샌드위치를 정렬하십시오 : 음극, 샌드위치 폼, 여과지 헹굼 SDS-PAGE 젤, 헹굼 된 니트로 셀룰로오스 멤브레인, 여과지, 샌드위치 폼, 양극. 완료되면 조립 된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90 분 동안 90 볼트 또는 30 분 동안 360 볼트로 작동합니다. 블로킹 완충액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 건조막을 차단한다.
1차 항체 및 베타-액틴의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 블로킹 완충액에서 배양합니다. 그런 다음 TBST를 각각 5 분 동안 세 번 씻으십시오. 세척된 막을 블로킹 완충액에 희석된 2차 항체와 함께 60분 동안 인큐베이션하고, TBST의 3회 세척을 반복한다.
완료되면 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 신호를 현상하려면 이미징 보드를 이미징 시스템으로 전송하기 전에 동일한 부피의 강화된 각 화학발광 시약을 멤브레인에 혼합하여 준비된 용액을 퍼뜨립니다. HEK293 세포를 스타우로스포린 및 N-에틸말레이미드 또는 NEM으로 처리하면 SPAK 표적 부위, T-루프 키나아제 도메인에 위치한 트레오닌 233 및 내인성으로 발현된 SPAK의 S-루프 인산화 부위 세린 373에서 인산화가 감소했습니다.
스타우로스포린은 KCC2b를 안정적으로 발현하는 HEK294 세포에서 세린 940의 인산화를 감소시켰지만, NEM은 그의 인산화를 상당히 증가시켰다. 또한, 스타우로스포린은 트레오닌 505 부위에서 인산화를 감소시키는 반면, NEM은 동일한 부위에서 인산화를 약간이지만 미미하게 증가시켰다. 트레오닌 505 부위에서 단백질 키나아제 C의 인산화와 세린 940 부위에서의 KCC2b의 인산화에 대한 두 화합물의 차별적 효과는 잘 상관 관계가 있습니다.
대표적인 결과는 또한 NEM이 총 KCC2 양의 발현을 유의하게 증가시킨 반면, 총 NKCC1 및 SPAK의 발현은 두 화합물 모두로 처리했을 때 유의하게 변하지 않았음을 보여주었다. 또한, 두 화합물은 트레오닌 233 및 세린 373 부위에서 SPAK의 인산화를 감소시켰고, 이는 트레오닌 906/1007 및 트레오닌 203/207/212의 축약된 인산화와 각각 내인성으로 발현된 NKCC1과 상관관계가 있었다. 추가적으로, 스타우로스포린 및 NEM은 세린 940 부위에서 단백질 키나아제 C의 인산화를 감소 및 증가시켰으며, 이는 각각 스타우로스포린 및 NEM 처리시 트레오닌 505 부위에서 단백질 키나아제 C 델타의 인산화의 감소 및 증가와 상관관계가 있었다.
부적절한 1차 또는 2차 항체를 사용하면 이미징 중에 밴드가 보이지 않습니다. 또한 너무 낮은 농도의 항체를 사용하는 경우 신호가 보이지 않을 수 있습니다. 이 기술은 단백질의 정량 분석에 관련된 도구이며 효과적인 조기 진단 도구를 포함하여 많은 과학 및 자원 목적으로 사용할 수있었습니다.
