이 프로토콜은 세포 배양 실험의 진입 장벽을 낮추고 연구자가 동적 미세유체 환경에서 배양된 부착 세포 단층을 평가하고 특성화할 수 있도록 합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 단층 특성의 정성적 및 정량적 평가를 통해 추가 단층 의존적 실험의 기초가 될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 시험관 내에서 폐포 상피의 요약을 가능하게 하여 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI) 동안의 동적 반응을 탐색할 수 있습니다.
시작하려면 단일 채널 플로우 어레이를 가져옵니다. 초음파 수조에서 커버 유리 표면을 청소하십시오. 커버 유리를 실온에서 5분 동안 poly-d-lysine에 담그십시오.
그런 다음 섭씨 60도에서 30 분 동안 건조시킵니다. 다음으로 Mylar 스페이서에 양면 접착제를 부착합니다. 원고에 기술된 바와 같이 커버 글라스에 레이저로 절단하고, 채널 컷아웃이 정확하게 정렬되도록 한다.
직사각형 커버 유리를 맨 아래 접착 스트립에 부착합니다. 껍질을 벗긴 접착 용지를 사용하여 아직 노출된 접착제 부분을 덮습니다. 조립이 완료되면 시공에 단단하고 동일한 압력을 가하십시오.
탈 이온수로 채워진 주사기를 사용하여 채널을 헹굽니다. 채널 인클로저를 자외선 살균기로 30분 동안 소독합니다. 멸균 기술을 사용하여 PBS에서 준비된 인간 피브로넥틴 용액으로 채널을 처리하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.
멸균 층류 후드에서 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 NCI H441 세포 현탁액을 준비합니다. 이 셀 현탁액 0.25ml를 사용하여 채널과 포트의 일부를 채웁니다. 명시야 현미경을 사용하여 세포가 채널 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
미디어 저장소와 스톱콕을 채널에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 채널 배양을 시작합니다. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용하여 사용한 배지를 채널에서 빼내고 새 매체를 채널 주입구에 부착된 멸균 매체 저장소에서 채널로 끌어냅니다.
화학 흄 후드에서 4 % 포름 알데히드 용액을 DPBS로 희석하여 1 % 용액을 만들고 적절하게 라벨이 붙은 튜브에 보관하십시오. 비슷한 방식으로 2 % 포름 알데히드 용액을 준비하십시오. 포름알데히드 용액을 적절하게 라벨이 붙은 5밀리리터 주사기로 옮깁니다.
세척 단계에 사용할 별도의 20밀리리터 주사기에 20밀리리터의 DPBS를 넣습니다. 다음으로, 배양 장치로부터 미세유체 채널을 분리하고, 이를 케미컬 흄 후드에 고정한다. 고정 및 염색 장치를 조립하려면 호스 바브 어댑터에 대한 수 루어 잠금 장치를 통해 3방향 스톱콕의 측면 포트에 이송 튜브 세그먼트를 부착합니다.
그런 다음 스톱콕을 플로우 어레이의 입구 포트에 연결합니다. 동일한 유형의 호스 바브 어댑터를 사용하여 기존 스톱콕의 출구 포트에 이송 튜브의 다른 부분을 부착합니다. 마지막으로, 현재 폐기물 라인으로 지정된 두 이송 튜브의 자유 끝을 화학적 및 생물학적 위험에 적합한 폐기물 용기에 고정합니다.
스톱콕이 플로우 어레이 입구 포트를 막고 있는지 확인하고 DPBS로 폐기물 라인을 세척합니다. 그런 다음 마개를 돌려 폐기물 라인을 차단하고 2 밀리리터의 DPBS로 세포를 천천히 씻으십시오. 채널을 통해 1% 고정액 2밀리리터를 천천히 밀어 넣습니다.
5분 동안 그대로 두었다가 2% 고정제로 반복합니다. 그런 다음 이전에 입증된 바와 같이 신선한 DPBS로 세포를 3회 세척합니다. 원고에 설명된 대로 0.1% 사포닌 용액을 준비합니다.
세척 단계에 사용하기 위해 20밀리리터 주사기에 추가 DPBS를 넣습니다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮으십시오. 필라멘트 액틴 염색 팔로이딘 시약과 핵 염색 Hoechst 시약을 0.1% 사포닌 용액에 추가합니다.
그런 다음 용액을 호일로 덮인 주사기로 옮깁니다. 소량의 투과화 및 염색 용액으로 폐기물 라인을 세척하십시오. 그런 다음 2 밀리리터의 용액을 미세 유체 채널에 주입합니다.
빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일로 채널을 덮으십시오. 30분 후, 채널을 부드럽게 건조시키기 전에 각각 5분 동안 2밀리리터의 DPBS로 투과화 용액을 씻어냅니다. 마이크로피펫을 사용하여 바닥면을 완전히 덮을 수 있도록 미세유체 채널에 최소한의 소프트 세트 페이드 방지 마운팅제를 도입합니다.
그런 다음 채널 끝을 밀봉하십시오. 명시야 현미경을 사용하여 채널이 빛으로부터 보호되도록 용기에 저장하기 전에 세포층의 무결성을 신속하게 확인합니다. 원하는 이미지 매개변수와 조건이 충족될 때까지 참조 스캔 및 z-스택을 수행하여 이미징 위치를 테스트합니다.
플로우 어레이 베이스 플레이트를 기준으로 사용하여 채널 길이를 따라 다양한 위치에 z-스택을 구성합니다. 마지막으로 단면 데이터, 깊이 맵 데이터 및 기타 관련 특성을 분석하여 세포층 속성을 평가합니다. 이 기술의 성공적인 사용은 입구와 출구에서 최소 1cm 떨어진 이미지 획득을 통해 미세유체 동적 배양 환경에서 입증됩니다.
대표적인 배양 기간 실험에서, 세포를 24시간 동안 배양하였을 때 성공적인 단층 생산이 관찰되었다. 그러나, 48시간 동안 배양하였을 때, 바람직하지 않은 다층 형성이 나타났다. 5개의 미세유체 채널 이미징 위치 각각에서 수집된 데이터는 또한 증가된 배양 기간과 증가된 단면적 사이의 관계를 보여주며, 이는 배양 후 48시간 이내에 고르지 않은 층 형성 또는 과증식이 발생함을 시사합니다.
24시간 동안 배양된 미세유체 채널 내 중앙 위치의 깊이 맵이 얻어졌으며, 이는 층 특성의 정성적 평가에 유용하다. 이 프로토콜의 가장 중요한 세 가지 측면은 적절한 채널 구성, 정확한 배양 및 배지 흐름 조건, 고정 및 염색 장치의 신중한 사용입니다. 이 절차에 따라, 전기 세포-기질 임피던스 감지, ECIS 또는 경상 피 전기 저항 (TEER)과 같은 생성 된 세포 단층의 실험적 생존성을 검증하기 위해 다른 방법을 병렬로 사용할 수 있습니다.
