이 방법은 시간에 따라 분비 속도가 어떻게 변하는지, 그리고 세포가 시간에 따라 변화하는 고체 신호에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 비용으로 훈련이 거의 필요하지 않으며 새로운 실험에 profusion 시스템 설정을 적용 할 수 있다는 것입니다. 하나의 주사기를 배경 용액으로 채우고 첫 번째 주사기 펌프에로드하십시오.
다른 주사기를 트레이서 용액으로 채우고 두 번째 주사기 펌프에 적재하십시오. 루어 커넥터를 사용하여 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결합니다. 스톱콕을 배경 용액으로 닫고 트레이서 용액을 열린 포트에서 떨어질 때까지 스톱콕에 펌핑하십시오.
펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. 주사기 펌프 이동 막대가 주사기 플런저에 대해 위로 밀려 펌프가 시작될 때 즉시 흐름이 시작되도록하십시오. 트레이서 용액에 스톱콕을 닫고 모든 잔류 트레이서 용액이 열린 포트에서 플러시될 때까지 배경 용액을 스톱콕으로 펌핑합니다.
펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. RTD 분석에 원하는 흐름 시스템 구성 요소를 설정합니다. 끝을 피펫 팁 디스펜서에 삽입하고 완전히 채워질 때까지 구성 요소를 통해 배경 용액을 펌핑하십시오.
트레이서 용액의 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 백그라운드 솔루션에 대한 stopcock을 닫고 트레이서 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 동시에 분수 수집기를 시작하십시오.
트레이서 솔루션의 흐름을 짧은 시간 동안 계속하여 트레이서의 임펄스 입력을 근사화합니다. RTD의 경우 시간당 1밀리리터의 유속으로 10분의 펄스 지속 시간을 사용하는 것이 좋습니다. 트레이서 용액 펄스 기간이 끝날 때 트레이서 용액 펌프를 정지하십시오.
트레이서 솔루션에 대한 스톱콕을 빠르게 닫고 동일한 유속으로 배경 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 모든 트레이서가 시스템을 통과하여 수집된 분획으로 들어갈 때까지 배경 솔루션이 흐르고 분수를 수집하도록 허용하십시오. 멸균 조건 하에서, 바늘이 있는 마개를 바늘을 뽑아 웰 플레이트 배양물에 삽입한다.
마개가 제자리에 놓인 후, 출구 바늘의 높이가 안정한 액체 수준을 결정함에 따라 관류를 위해 바늘을 원하는 높이로 낮 춥니 다. 바늘을 수컷 루어 캡으로 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 섭씨 37도에 설정된 인큐베이터에 전체 웰 플레이트를 보관하십시오. 관류에 사용할 두 개의 배지를 준비하여 먼저 분배 될 배지를 하나로, 다른 배지를 두 개로 표시하십시오.
각 배양물이 관류되도록 한 개의 주사기를 배지로 채워 연금의 전체 지속 기간과 관류 시스템을 초기에 채우기에 충분한 부피를 더합니다. 두 번째 주사기를 중간 두 개로 채워 연금의 전체 기간을 지속하십시오. 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결하십시오.
주사기를 스톱콕에 연결하기 위한 튜빙의 길이가 필요할 수 있다. 중간 하나에 대한 스톱콕을 닫고 열린 포트에서 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 중간 매체 두 개를 스톱콕에 분배하여 스톱콕을 준비하십시오. 그런 다음 중간 두 개에 대한 스톱콕을 닫고 모든 잔류 매체 두 개가 열린 포트에서 플러시 될 때까지 매체 하나를 스톱콕에 분배하십시오.
암-헛간 루어 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 개방형 스톱콕 포트에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 있는 미늘 루어 커넥터에 남성을 삽입합니다. 상류 튜브가 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지 하나를 분배하고 앞서 입증된 바와 같이 하류 튜빙의 준비를 진행한다.
수컷 투 바브 루어 커넥터를 다운스트림 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 암 루어 캡으로 캡핑합니다. 준비된 모든 튜브, 주사기 및 웰 플레이트를 관류에 사용할 인큐베이터로 조심스럽게 가져 오십시오. 주사기 펌프와 분획 수집기를 인큐베이터 근처의 원하는 위치에 놓습니다.
주사기 펌프를 인큐베이터 위 또는 근처에 놓고 분획 수집기를 포트 근처의 인큐베이터 옆에 놓습니다. 주사기를 펌프에 적재하십시오. 모든 상류 및 하류 튜브의 뚜껑이 덮인 끝을 함께 묶어서 인큐베이터 외부에서 포트를 통해 내부로 밀어 넣으십시오.
다운스트림 튜브의 열린 끝을 분수 컬렉터의 다중 헤드 디스펜서의 분배 피펫 팁에 삽입합니다. 인큐베이터 내부에서, 흐르는 매체가 열과 이산화탄소를 받을 수 있는 튜브의 길이를 최대화하기 위해 상류 튜브의 느슨한 부분을 인큐베이터로 가능한 한 많이 당겨 넣는다. 각 꽂힌 우물에 대해 바늘과 상류 및 하류 튜브의 뚜껑을 신속하게 풀고 루어 커넥터와 함께 부착하십시오.
모든 부품이 연결되면 주사기 펌프를 비교적 빠른 속도로 간단히 실행하여 모든 스트림이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오. 이 시점에서, 매체로 가득 찬 다운스트림 튜브로 실험을 시작하고자 하는 경우, 모두가 채워질 때까지 펌프를 계속 가동하고, 그렇지 않으면 펌프를 정지시킨다. 중간 하나에 대한 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오.
배지 공급원을 변경해야 할 때, 중간 공급원을 위한 주사기 펌프를 신속하게 정지시키십시오. 스톱콕을 중간 크기로 닫은 상태로 돌리고 중간 두 개의 주사기 펌프를 시작하십시오. 나중에 원하는 경우 소스를 다시 중간 소스로 전환하십시오.
원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다. 두 개의 RTD 실험에서 분획의 트레이서 농도를 측정하고 데이터 MATLAB 스크립트에서 RTD에 입력하여 두 개의 RTD를 생성했습니다. 단일 튜브와 직렬로 연결된 여러 개의 튜브 조각이 단일 축 분산 모델에 의해 잘 맞고 관류 된 48 웰 플레이트를 라인에 추가하면 무시할 수있는 편차가 발생하여 한 미터 튜브 RTD와 전체 시스템의 RTD가 축 분산 기능에 맞을 수 있습니다.
불량한 모델 적합성의 예는 1미터 튜브 RTD 데이터에 적합된 축방향 분산 모델을 사용하여 입증되었으며 데이터와 함께 플롯팅되었습니다. 초기 파라미터 추측은 타우가 용적 유량으로 나눈 관류 시스템 부피와 거의 동일한 양호한 모델 핏을 생성하도록 변경되었습니다. TNF-알파의 90분 펄스는 시스템에 대한 입력 신호로서 정의되었고, 웰 플레이트 입구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 일미터 튜빙 RTD와 컨볼링되었다.
입력 신호는 또한 수집된 분획에서 시스템의 출구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 전체 시스템의 RTD와 컨볼링되었다. HEK 293 세포는 NF-카파B 반응 요소를 함유하는 프로모터에 의해 구동되는 GLuc를 분비하도록 조작되었다. 실험은 TNF-알파 노출 후 NF-카파B에 의해 구동되는 GLuc 발현의 유의한 발현 증가 및 느린 감소를 밝혀냈다.
시스템의 변형은 신호를 입력하고 세포를 제약 후 결합 용질 프로파일에 노출시킬 필요가없는 실험을위한 간단한 설정을 포함하여 첨부 된 논문에 설명되어 있습니다.
