이 프로토콜은 살아있는 이식 전 마우스 배아에 포토스타틴을 적용하는 최초의 프로토콜이며, 다른 3D 생리 시스템에서 광 전환 가능한 약물을 사용하는 용도와 관련이 있습니다. 광 전환 가능한 포토스타틴은 공간과 시간에서 미세 소관 성장을 조작하고 다시 꺼진 상태로 전환 할 수 있습니다. 실험 전에 의도하지 않게 포토스타틴을 청색광에 노출시키면 조기에 활성화될 수 있습니다.
따라서 샘플을 준비 할 때 항상 완전한 어둠 또는 적색 조명 조건에서 작업하는 것이 좋습니다. 엄격한 어두운 조건에서 조명에 적색 광 만 사용하여 초순수에서 PST-1P의 재고 및 중간 작업 용액을 만들기 시작하십시오. 텍스트 원고에 설명 된대로.
이어서, PST-1P를 신선한 KSOM에 희석하여 40의 최종 농도를 달성하 M.To 라이브 이미징용 챔버 슬라이드를 준비하고, PST-1P 처리된 KSOM 10 L를 하나의 웰의 중앙에 첨가하여, 반구형 액적을 형성하였다. 물방울이 증발하는 것을 방지하려면 충분한 미네랄 오일로 덮으십시오. 이어서, 제조된 배양 접시를 호일에 느슨하게 감싸거나, 배양 접시를 인큐베이터의 밀폐되지 않은 불투명 용기에 넣어 빛에 노출되지 않도록 한다.
배아를 PST-1P 처리 KSOM 방울로 옮긴 후, 배아가 액적의 중앙에 군집되어 있는지 확인하고 접시의 바닥에 정착시킵니다. 침지 대물 렌즈가 준비되면 챔버 슬라이드를 현미경, 환경 챔버 내부에 장착하십시오. 37 C 및 5 % CO2 및 완전한 어둠 속에서 모든 PST-1P가 비활성 트랜스 구성에 있고 배아가 접시 바닥에 가라 앉을 수 있도록하십시오.
적색광 토치를 사용하여 대물 렌즈를 침지 매체와 접촉하도록 배치합니다. 그런 다음 매체의 물방울 가장자리를 찾아 목표를 바로 위에 놓습니다. 라이브 스캐닝 모드 및 561 nm 레이저를 사용하여, 액적 내의 배아를 위치시킨다.
스테이지 컨트롤러와 라이브 스캐닝 모드를 사용하여 전체 배아의 z-스택을 획득하기 위한 시작점과 끝점을 설정합니다. 신호에 따라 레이저 전원 설정을 최대 5%까지 조정합니다. 신호에 따라 디지털 오프셋을 최대 0.900으로 설정하여 EB3-dTomato 혜성의 모양을 최적화하십시오.
배경 소음을 최소화합니다. 핀홀을 2m로 설정합니다. 512 x 512에서의 픽셀 해상도.
그리고 픽셀 체류 시간은 3.15 초입니다. 그리고 줌을 2x로 설정하십시오. 전체 배아의 z-스택을 1m 섹션 간격으로 획득하여 전체 유기체에서 미세 소관 성장 영역을 평가하십시오.
EB3-dTomato 혜성 추적 실험의 경우 3D z-스택 이미지를 열고 확대/축소를 3배로 늘립니다. 그리고 관심의 특정 하위 영역 주위에 직사각형 ROI를 그립니다. 그런 다음, 설정된 파라미터를 사용하여 500ms의 시간 간격으로 단일 z-평면의 시간 경과 무비를 획득한다.
PST-1P를 활성화하려면 405nm 레이저로 전환하고 레이저를 10 % 전력으로 설정하고 핀홀을 최대한 열었으며 픽셀 해상도 512 x 512, 픽셀 유지 시간 3.15 초, 500ms의 시간 간격으로 3 회 확대하고 획득 할 20 프레임을 설정하여 또 다른 시간 경과를 얻습니다. 활성화 직후, 561 nm 레이저로 다시 전환하고, PST-1P의 활성화 후 EB3-dTomato 혜성의 손실을 확인하기 위해 이전에 입증 된 바와 같이 획득을 반복하십시오. 이제 PST-1P를 비활성 트랜스 상태로 되돌리려면 514nm 레이저를 사용하고 설정된 매개 변수로 또 다른 시간 경과를 얻습니다.
EB3-dTomato 혜성의 회수를 시각화하려면 561nm 레이저로 다시 전환하고 획득을 반복하십시오. 처리되지 않은 대조군 배아에서, 405 nm 레이저로 조명하기 전에, EB3-dTomato 신호는 핵 영역을 제외한 세포의 전체 세포질 내에서 높았다. 조명 후 신호의 변화가 감지되지 않았습니다.
405 nm 레이저가 배아 또는 미세소관 역학에 광손상을 일으키지 않았음을 나타낸다. 16 세포 단계 배아의 PST-1P 처리 동안, 엄격한 어두운 조건 하에서, 강한 EB3-dTomato 발현이 3D 이미지에서 검출되었으며, 이는 비활성 PST-1P가 어두운 조건하에서 미세 소관 중합의 억제를 유도하지 않는다는 것을 입증했다. PST-1P의 활성화 전에, 단일 z-평면의 타임랩스 이미징은 아세포 영역에서 강한 EB3-dTomato 발현 및 미세소관 중합을 확인하였다.
405 nm 광 활성화 후, 수초 이내에, EB3-dTomato 혜성 신호의 감소가 검출되었다. 신호의 회수는 514 nm 레이저를 사용하여 PST-1P의 비활성화시 달성되었다. EB3-dTomato를 주입하고 PST-1P와 함께 배양한 배아는 정상적인 배아 잠재력을 보였으며, 배반포 단계로 발전했다.
및 유사분열 동안 정상적인 미세소관 역학. 배아에 대한 활성 PST-1P의 비독성을 나타낸다. 획득 한 타임랩스 영화에서 EB3-dTomato 라벨링은 혜성과 같은 구조로 등장하여 성장하는 미세 소관 필라멘트의 추적을 가능하게했습니다.
암흑 조건에서 유지되는 PST-1P 처리 배아에서, 개별 EB3-dTomato 혜성은 초기 마우스 배아에서 비 센트로솜 미세 소관 조직 센터로서 작용하는 간상 교량으로부터 방출된다. t-스택은 위상 간 교량 영역에서 EB3-dTomato 혜성을 보여줍니다. PST-1P의 활성화 이후, EB3-dTomato 혜성은 상간 교량의 기저부와 t-스택에서 감소되었다.
백색광은 PST-1P를 조기에 활성화 할 수 있음을 기억하십시오. 따라서 가시성을 위해 적색 광원 만 사용하십시오. 녹색 표시등은 PST-1P를 비활성화하므로 녹색 형광 라벨 마커를 사용하지 마십시오.
이 기술은 초파리, 아메바, 마우스 및 다중 시험관 내 시스템에서 세포 이동 및 조직 형성을 연구하기 위해 미세 소관 성장을 표적으로 삼는 데 사용되었습니다.
