세포 생성 된 기계적 힘은 신체 전체의 다양한 기관에서 적절한 기능에 필수적입니다. 게다가 창자 방광, 심장, 그리고 다른 사람. 이러한 기관은 내부 지혈 상태를 유지하기 위해 세포 수축 및 이완의 안정적인 패턴을 생성해야합니다.
비정상적인 평활근 세포 수축은 근육 수축과 함께 장의 비정상적인 패턴을 특징 짓는 장 운동성 장애뿐만 아니라 과민성 또는 저활동 방광과 같은 상태를 포함하여 다양한 장애의 발병으로 이어질 수 있습니다. 그리고 기도에서 불규칙한 패턴을 수축시키는 일부 근육 세포는 천식 성 과민 반응을 유발할 수 있습니다. 분명히 세포와 조직 내의 수축 메커니즘은 치료 옵션이 필요한 질병으로 이어질 수 있습니다.
그리고 이러한 조건은 세포의 기능 장애 수축 행동에서 직접 유래 할 수 있기 때문에 잠재적 인 약물 후보를 스크리닝 할 때 세포 수축 기능 자체를 측정하는 것이 논리적이고 필요하게됩니다. 마이크로 기술의 최근 발전에 따라 우리는 단일 세포 수축의 정량적 측정을 가능하게하는 사용자 친화적 인 마이크로 플레이트 기반 분석을 개발했습니다. 플렉스(flex)라고 불리는 수십만 개의 세포에서, 형광으로 표지된 엘라스토머성 수축성 표면으로도 알려져 있다.
이 접근법에서, 우리는 형광 단백질 마이크로 패턴을 내장하고, 그래서 부드러운 필름을 내장하는데, 이는 세포가 견인력을 가할 때 변형되고 수축됩니다. 중요하게도, 단백질 마이크로 패턴은 세포 위치, 형상 및 확산 영역을 제한한다. 균일 한 테스트 조건은 치수 변화만을 기반으로 간단한 측정을 허용합니다.
전반적으로, 브라우저 기반 이미지 분석 모듈을 포함하는 플랫폼은 섬세한 취급 절차나 신탁 마커의 등록 없이도 계약 가능한 세포력의 간단한 분석을 가능하게 하며, 기본 세포 배양 및 낮은 배율의 간단한 형광 현미경을 사용하는 모든 연구자가 조작할 수 있습니다. 이 기술은 최종 사용자를 염두에두고 설계되었으며 모든 실험실 과학자가 세포 힘 생물학을 연구 할 수있는 진입 장벽을 줄이는 것을 목표로합니다 만성적 인 튜브에 20 밀리리터의 매체를 추가하여 시작하여 세포 수축성을 분석하도록 설계된 24 웰 플레이트를 얻습니다. 피펫을 500 마이크로 리터로 설정하고 세포 병원균을위한 세포 스트레이너를 얻으십시오.
24웰 플레이트의 뚜껑을 분리하고 플레이트를 위로 올린 다음 플레이트 상단의 플라스틱 층을 부드럽게 떼어냅니다. 조심스럽게 플레이트를 다시 내려 놓으십시오. 유출을 방지하기 위해 각 웰에서 최상층 PBS만을 흡인하십시오.
이제, 한 번에 한 줄씩, 나머지 PBS를 웰로부터 제거하고 500 마이크로리터의 세포 배지로 신속하게 채운다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 측면을 탭하여 우물의 바닥 전체가 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 모든 웰스가 미디어로 채워지면 플레이트를 옆으로 놓으십시오.
이 시점에서 인큐베이터에서 세포 배양물을 회수하십시오. 우리는 견고한 연관 프로토콜을 수행 할 것입니다. 이 프로토콜의 목적은 밀리리터 당 50, 000 세포의 현탁액을 생성하는 것이다.
세포를 시딩하기 전에 스트레이너를 통해 한 번 세포를 변형시켜 세포 덩어리를 단일 세포로 분해하려면 500 마이크로 리터의 세포 용액을 각 웰에 조심스럽게 넣으십시오. 세포 파종 후, 플레이트를 한 시간 동안 앉히는 것이 중요하므로 세포가 패턴에 직접 정착 할 수 있습니다. 한 시간이 지난 후, 플레이트를 하룻밤 사이에 인큐베이터에 넣으십시오.
실험의 두 번째 부분은 24-웰 플레이트에 약물을 추가하고 플레이트의 형광 이미징으로 구성됩니다. 프로토콜의이 부분에 대해 우리는 강력한 세포 생존력과 반응을 보장하기위한 두 가지 중요한 요구 사항을 가지고 있습니다. 첫 번째는 세포가있는 우물에서 DMSO의 최종 농도가 1 %를 넘지 않는다는 것입니다.이는 우리가 약물 재고에서 100 완전 희석을해야한다는 것을 의미합니다.
두 번째는 DMSO가 혼합의 바닥으로 추락하여 높은 수준의 농도로 세포에 해를 끼치 기 때문에 DMSO를 웰에 직접 추가 할 수 없다는 것입니다. 대신, 우리는 DMS0 약물과 배지의 중간 용액을 만들어야하며, 세포에 대한 높은 국소 DSSO 노출을 피하기 위해 철저히 함께 혼합 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 40 마이크로 몰에서 하나의 나노 몰까지의 범위를 커버하는 여섯 단계 여덟 배 희석을 수행 할 것입니다 30 마이크로 리터의 원약 용액을 연속 210 마이크로 리터 부피의 DMSO로 옮기고 각 전달 단계 사이에 철저히 혼합하여 여섯 단계 8 배 희석 시리즈를 만듭니다 우리의 실험에서, 우리는 blebbistatin의 효과를 평가할 것입니다.
근육 세포를 통해 인간의 방광에. 두 가지 요구 사항을 모두 충족시키기 위해 먼저 중간 약물 DMSO 및 미디어 솔루션을 만들 것입니다. 이는 DMSO의 16.7배 희석을 산출한다.
그런 다음 우리는 추가 6 배 희석을 산출하는 비율을 사용하여이 중간 약물 용액을 세포에 첨가하여 총 100 개의 완전 희석 및 1 % DMSO의 최종 농도를 산출하여 이를 달성하기 위해 각 원약 용액에 대해 30 마이크로 리터의 약물을 470 마이크로 리터의 세포 배양 배지에 혼합 한 다음이 중간 용액 200 마이크로 리터를 24 웰 플레이트의 적절한 웰로 옮기고, 각 우물에 1000 마이크로 리터가 들어 있습니다. 이것은 적절한 시간 동안 집단적으로 1%의 최종 농도의 DMSO 인큐베이트를 산출한다. 우리의 실험에서, 우리는 30 분 동안 배양하고, 당신이 이미지를 만들 준비가되면 웰스 전체에 살아있는 핵 얼룩을 추가하여 주식에서 10, 000 희석액을 추가하십시오.
추가 15 분 동안 인큐베이션하도록하십시오. 이미지를 촬영할 준비가 되면 표지된 세포 핵과 형광 염료 모두에 대한 형광 채널을 이미지화할 수 있는 형광 현미경이 필요합니다. 마이크로 패턴은 이 예제에서 tri C 채널인 레이블이 지정됩니다.
이제, 우리는 단일 세포를 확인하기 위해 블레비스타틴 핵을 형광 이미징 할 것이며, 분석 중에 정렬 될 수 있도록 마이크로 패턴을 보는 것과 정확히 동일한 위치에서 염색 된 세포 핵을 이미지화해야합니다. 획득한 이미지를 컴퓨터에 업로드하면 패턴 채널이 밑줄 PT로 끝나도록 이미지에 레이블이 올바르게 지정되어 있는지 확인합니다. 그리고 핵 채널의 이미지는 밑줄 dapi로 끝납니다. 이제 이미지 J가 열리면 한 번에 하나의 채널에로드하는 이미지 J를 사용하여 tif 이미지를 PNG 이미지로 변환합니다.
먼저 신호를 최대화하고 배경을 최소화하기 위해 패턴 채널을로드하고 대비를 조정합니다. 또한 이미지를 매끄럽게 처리 할 것입니다. 이미지가 원하는대로 수정되면 이미지 유형을 여덟 비트로 변경합니다.
그런 다음 이미지를 PNG 유형으로 내보냅니다. 그런 다음 상자를 선택하고 슬라이스 레이블을 파일 이름으로 사용하십시오. PNG라는 새 폴더를 만듭니다.
그런 다음 PNG 파일을 거기에 저장하고, 이미지를 분석하려면 Biodock dot AI로 이동하고, 계정을 만들고, 저자에게 연락하여 분석 모듈에 무료로 액세스 할 수 있습니다. 계정이 생성되면 로그인합니다. 여기에서 새 이미지를 업로드할 수 있습니다.
우리는이 새로운 배치, 웹 실험 데이터 JoVE라고 부를 것입니다. 이제 이미지를 드래그 한 다음 드롭하여 이미지를 가져 오고이 시점 OK.At 누르고 데이터를 선택할 수 있습니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 수축성 분석이라고 표시된 모듈로 스크롤 한 다음 선택을 누르십시오.
배율을 이미징에 사용한 값과 동일한 값으로 설정하면 데이터가 완료되면 클릭하면 데이터 다운로드를 선택할 수 있습니다. 데이터가 다운로드되면 입력 된 모든 이미지에 대해 오버레이 된 이미지 쌍을 볼 수 있습니다. 우리는 또한 각 세포 세트에 대한 평균 수축을 제공 할 요약 통계에 액세스 할 수 있습니다.
수축에 대한 측정 단위는 픽셀 단위입니다. 여기서 데이터를 살펴보면 DMSO로만 처리된 웰에서는 블레비스타틴으로 처리된 세포에 비해 훨씬 더 높은 세포 수축이 있었다는 것을 알 수 있습니다. 우리는 또한 모든 이미지에서 감지 된 모든 단일 패턴에 대한 데이터에 액세스 할 수 있습니다.
이것은 우리에게 이미지의 위치, 이미지 원점, 위치 유형, 셀 수, 하나 이상의 영점, 마이크로 패턴의 크기 및 세포의 계산 된 수축에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 이 레이는 마이크로 플레이트 내에서 식별된 모든 단일 패턴으로 구성됩니다. 이 목록의 단일 셀 패턴은 다른 파일의 PNG 이미지에 대한 평균 수축을 계산하기 위해 평균이었습니다.
실험에 필요한 대로 단일 셀 데이터를 정렬하고 분석할 수 있습니다. 비디오의이 부분에서는 두 가지 약물로 처리 된 방광 평활근 세포의 반응 데이터를 보여주는 24-웰 플레이트에서 수집 가능한 대표 데이터를 표시합니다. 이들은 각각 DMSO 및 블레비스타틴으로 처리된 웰의 이미지이다.
여기서, DMSO로만 처리된 세포는 다수의 수축 마이크로 패턴을 나타내지만, 블레비스타틴으로 처리된 세포는 더 크고 개방되어 수축이 적다는 것을 알 수 있다. 이 히스토그램의 데이터는 세포에 대한 다양한 처리의 결과로 변이 세포 수축성을 표시합니다. 블레비스타틴으로 처리된 세포에 대한 분포의 중심은 DMSO로 처리된 세포에 대한 분포의 중심보다 낮다.
이는 이전 이미지에 표시된 정보와 일치합니다. 블레비스타틴으로 처리된 세포는 훨씬 더 작은 수축을 나타내었기 때문이다. 이것은 blebbistatin으로 처리하면 세포가 상당히 이완된다는 것을 나타냅니다.
이러한 데이터 세트 각각은 비디오에 표시된 프로토콜에 따라 단일 24-웰 플레이트에서 수집 가능한 용량 반응 곡선의 한 지점에 기여합니다. 여기에서, 우리는 cytochalasin D가 약물의 높은 농도를 감안할 때 수축의 낮은 값에 의해 보여지는 바와 같이 blebbistan보다 더 강력하다는 것을 알 수 있습니다. 실험을 크게 확장하려는 경우 384 웰 플레이트 버전을 사용할 수 있으며 자동화와 함께 사용하여 실험을 극적으로 확장할 수 있습니다.
이 데이터는 24-웰 플레이트 상의 각 약물에 대해 6개의 희석 단계를 갖는 것이 아니라 384 웰 플레이트로부터 수집될 수 있으며, 384 웰 플레이트는 다중 반복실험으로 각 약물에 대해 20개의 희석 단계를 수행할 수 있게 한다. 눈송이 기술은 독특합니다. 현미경을 사용하여 단일 세포 수축을 시각화 할 수 있으며 지금까지 불가능했습니다.
따라서 기술은 형광 표지 단백질로 패턴화 된 메트릭의 형태에 의존합니다. 체계적인 패턴은 세포 수축을 위해 형성되고 주어진 약물에 의한 표현형의 계약의 조절을 정확하게 측정 할 수있게합니다. 물론,이 기술은 천식, 심혈관 질환, 염증 면역 종양학 및 물론 비정상적인 세포 수축이 질병 진행에 중요한 역할을하는 우리의 질병 징후와 같은 많은 다른 질병 영역과 응용 프로그램을 위해 여전히 활발히 개발되고 있습니다.
우리가 시연하듯이 세포 수축성을 측정하기 위한 이 마이크로 패터닝 기반 기술은 전통적인 견인력 현미경 검사에 대한 단순화된 대안을 제공하고, 직관적인 분석을 제공하고, 패턴이 축소되는 것을 관찰하고, 대규모 세포 집단에서 단일 세포 분해능을 제공한다. 몇 가지 고려 사항,이 방법은 T 세포 및 호중구와 같이 너무 작은 세포 또는 부착되지 않는 세포 유형의 사용에 대한 도전을 제기 할 수 있습니다. 또한 매주 결합하거나, 주로 서로 결합하거나, 완전히 퍼지지 않는 세포는 측정 가능한 수축 신호를 생성하지 않습니다.
이 기술의 사용자는 특정 세포 유형에 대해 가능한 다양한 세포 배양 배지 제형을 신중하게 평가해야합니다. 다른 구성 요소로서, 성장 인자, 혈청 수준 및 pH 민감성은 다양한 행동을 유발할 수 있습니다. 프로토콜의 최적화는 모든 실험 워크플로의 확장을 진행해야 합니다.
궁극적으로 단일 세포 분해능이 필요하지 않거나 표적 세포 유형이 최소한의 확산 능력을 갖는 경우, 그러한 실험에 전통적인 인력 힘 현미경 방법을 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면이 도구가 세포 생물 학자들이 세포 수축을 연구하고 연구를 수행 할 수있는 추가 방법을 제공하기를 바랍니다.
