이 프로토콜을 사용하면 세포주 전체에서 재현 가능한 간단한 비용 효율적인 방법으로 발달하는 인간의 심장과 밀접하게 유사한 복잡한 3D 구조를 만들 수 있습니다. 그것은 분화의 3 단계를 가진 단일 프로토콜로 구성, 이는 심장의 모든 세포 유형을 초래, 챔버와 혈관 네트워크를 포함. 이 기술은 우리가 인간의 심장 혈관 질병의 넓은 범위를 모델링하고 효과적인 약리학적 치료를 선별 할 수 있습니다.
디자인의 높은 처리량 특성 덕분에. 이 방법은 일반적으로 그와 관련된 질병뿐만 아니라 개발 인간의 심장을 조사하는 데 유용합니다. 그 중 하나는 선천성 심장 결함입니다.
이 프로토콜에는 기본적인 세포 배양 기술이 필요합니다. 우리는 오가노이드의 세심하고 섬세한 피펫팅뿐만 아니라 부드러운 취급을 권장합니다. 분화 이틀 전에 배아 체 나 EB를 만드는 것으로 시작합니다.
DBPS로 서브컨블아웃 HPSC를 10초 이상 세척합니다. 그런 다음 DPBS를 흡인합니다. 실온 ACUTA의 1 밀리리터를 추가하고 현미경으로 확인하는 동안 분리를 유도하기 위해 3~5분 동안 매 분당 약 5회 접시를 부드럽게 누릅니다.
그런 다음 PSC 배지와 티아스 아빈 또는 티아스 1 밀리리터를 추가하여 반응을 중지합니다. 파이펫은 미디어를 우물에서 위아래로, 2~3회 하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 수집한다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 300회 G.에서 5분간 회전하여 슈퍼나탈을 흡인하고 PSC 배지 및 티아스 1밀리리터로 세포를 다시 소비한다.
DPBS의 세포를 희석시. 세포 카운터 또는 헤모 낭포계를 사용하여 세포를 계산하고 밀리리터 당 100, 000 세포의 농도로 티아스와 PSC 배지에서 세포를 희석. 희석 된 셀 현탁액 100 마이크로 리터를 둥근 바닥 초저 부착 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
플레이트를 3분 동안 100배G로 원심분리하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 조심스럽게 각 우물에서 50 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 200 개의 신선한 PSC 매체를 추가하여 섭씨 37도까지 따뜻하게 하여 웰당 250 마이크로리터의 부피를 제공합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
각 우물의 한쪽에서 166 마이크로리터 또는 매질의 2/3을 제거하고, 인슐린 무료 B27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 마이크로리터 166편, 990211 6개, 체형 유전자 단백질 의 밀리리터 당 0.875 나노그램, 액티비틴 A.Incubate 의 밀리리터 당 1.5 나노그램을 24%의 섭씨 57%에서 제거합니다. 후 24 6 각 우물의 한쪽에서 매체의 마이크로 리터166 마이크로 리터를 추가 하 고 추가 166 신선한 RPMI의 마이크로 리터 1640 인슐린 무료 B27 보충. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양하세요.
둘째 날에 심장 중피 사양을 유도하기 위해 각 우물에서 166 마이크로리터를 제거하고 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가하여 인슐린 무료 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 Wnt-C59를 함유하고 48시간 동안 배양을 계속합니다. 4일째에, 각 우물에서 166 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 인슐린 무료 B27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가한 다음, 또 다른 48시간을 배양합니다. 6일째에는 각 우물에서 166마이크로리터의 미디온을 제거하고 B27 보충제로 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.
이 모든 후속 미디어 변화에 대 한, 사용 B27 인슐린과 보충, 다른 24 시간 동안 배양. 7일째에, 세포 배양은 프로 상근 분화를 위한 준비가 되어 있습니다. 각 우물에서 166 마이크로리터의 매체를 제거하고 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 응원 99021을 함유한 신선한 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 1 시간 동안 인큐베이션에서 1 시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 우물의 한쪽에서 166 마이크로 리터를 제거하고 B27 보충제를 함유 한 신선한 RPMI 1640의 마이크로 리터 166 마이크로 리터를 추가하여 다른 48 시간 동안 인큐베이션을 계속합니다. 수집 될 때까지 48 시간마다이 과정을 반복하십시오. 오르가노이드는 15일째에 분석 및 실험을 통해 전체 오르가노이드를 옮기고, P200 파이펫의 끝을 약 2~3mm의 직경으로 개구부에서 5~10mm 로 자른다.
파이펫 플런저를 누르고 오간로이드와 잘 둥근 바닥에 팁을 수직으로 삽입합니다. 오르가노이드를 수집하고 대상 대상으로 전송할 수 있을 만큼 약 100~200마이크로리터의 매체를 차지합니다. 분화 EBS가 흑인 구형 덩어리로 나타나기 전에 분화 과정은 정확히 24 시간 동안 Wnt 통로 활성화 및 성장 인자 추가로 0 일째에 시작됩니다.
또한 2일째에 Wnt C59의 편집은 오르가노이드를 약 200 마이크로미터에서 최대 1mm로 확대시키는 결과를 낳습니다. 인간 심장 오르가노이드는 6일째와 100%의 오르가노이드가 10일째에 눈에 보이는 박동을 보였기 때문에 일찍 부터 뛰기 시작했습니다. 7일째 의 높은 배율 이미지는 대부분의 손 발현 세포가 원점에서 심근세포이고 손 2개는 제2 하트필드, 선조 세포로부터 비심근세포였다는 것을 밝혔다.
손 1과 손 2모두에 대한 RNA 전사체는 RNA 시퀀싱 데이터에서 3일째부터 발현되었다. FHF 마커는 3일과 11일 동안 높게 발현되었으며, SF 마커는 13일 이후 더 높게 표현되었다. 면역형광 얼룩은 인간의 심장을 구성하는 다양한 인간 심장 세포 형 혈통의 존재를 밝혔다.
심근 및 상복부 조직, 내막 세포, 내피 세포 및 심장 섬유아세포와 같은. 상기 세포 계보를 발현하는 마커는 RNA SAC 유전자 발현 프로파일에서도 관찰되었다. 전체 오르가노이드에서 개별 세포의 살아있는 칼슘 화상 진찰은 오르가노이드의 전기 생리학적 기능을 측정하는 데 사용되었다.
플루오-4 형광 강도는 정기적인 작용 잠재력을 드러내는 세포에서 칼슘 입구 출구로 인해 시간이 지남에 따라 다양합니다. 오르가노이드의 높은 배율 영역에 걸쳐 칼슘 강도를 보여주는 열지도, 칼슘 과도 및 개별 세포로 인한 증가 강도를 보여줍니다. 이 프로토콜을 시도할 때, EB와 후속 오르가노이드가 플레이트 의 바닥에 부착되지 않으며 세심한 미디어 변경이 필요한 미디어 외에도 제거와 함께 움직일 것입니다.
오르가노이드는 성숙 기술에 도입된 장기간 배양또는 기계적 또는 전기 컨디셔닝과 같은 외부 자극, 독소와 같은 스트레스 요인에 노출될 수 있습니다. 이 기술은 연구에서 달리 접근 할 수없는 인간의 태아 심장 발달 단계에 대한 액세스를 허용, 심장 발달과 질병 병인학에 대한 새로운 통찰력의 길을 포장.
