이 프로토콜은 NanoSight LM10의 초보 운영자를 위해 개발되었습니다. 단계별 지침을 따르면 정확하고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 사용자의 기술 수준에 관계없이 여러 평가판 실행에서 일관된 결과를 보장하는 데 도움이 됩니다.
나노입자 특성화, 특히 정량화는 세포밖 소포 연구 분야에서 계속 도전이 되고 있다. 이 프로토콜은 현탁액 중 나노 입자의 일관된 크기 및 농도 분석을 허용합니다. 먼저 레이저 모듈의 유리 표면을 양질의 렌즈 클리너와 렌즈 용지로 청소하십시오.
모듈을 조립하기 전에 O 링 씰이 플로우 셀 커버의 홈에 제대로 장착되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 흐름 셀 커버를 레이저 모듈에 올려 놓고 전기 접점이 올바른 방향에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 스프링이 장착 된 네 개의 엄지 나사를 흐름 셀 플레이트를 통해 놓고 개별적으로 조이지 않고 레이저 모듈의 나사를 맞 춥니 다.
플로우 셀 커버에 균일한 압력을 가하면서 엄지 나사를 대각선으로 교대로 조여서 꼭 맞을 때까지 조입니다. 슬립 잠금 어댑터로 두 밀리리터의 튜버큘린 주사기를 DPBS 한 밀리리터로 세 번 플러시합니다. 주사기를 나머지 포트에 삽입하기 전에 첫 번째 투베르쿨린 주사기로부터 플런저를 제거하고 폐기하여 보이드 희석제 또는 샘플 저장소로서 작용한다.
그런 다음 두 번째 주사기를 한 밀리리터의 DPBS로 채우고 흐름 셀 덮개의 입구 포트에 부착하십시오. DPBS가 레이저 모듈에 천천히 주입될 때 챔버에서 공기가 정화될 수 있도록 출구 주사기 포트를 상승된 상태에서 기울어진 레이저 모듈을 잡으십시오. 한 밀리리터의 공기를 입구 포트에 주입하여 레이저 모듈에서 나머지 DPBS를 플러시합니다.
플러시를 두 번 반복합니다. 마지막 플러시 후 레이저 모듈을 가능한 한 완전히 비우고 초점을 맞추고 포지셔닝을 위해 모듈을로드하십시오. 소프트웨어를 엽니다.
왼쪽 위 모서리 상자의 캡처 탭에서 카메라 시작을 클릭합니다. 다섯 분 후에 카메라가 자동으로 꺼지면 카메라 시작을 클릭하여 다시 시작합니다. 동일한 탭에서 카메라 레벨을 14 ~ 16으로 조정하여 레이저 라인을 밝게하고 입자 식별 및 초점을 단순화하십시오.
헤드 피스의 왼쪽에 있는 상단 슬라이더를 안팎으로 이동하면 이미지가 카메라에서 아이피스로 전환됩니다. 시야각에서 지문 및 중심이라고 하는 밀도가 증가한 영역을 찾고 지문을 세로로 초점을 맞춥니다. 시야각에서 레이저 라인의 중앙에 배치한 다음 상단 슬라이더를 움직여 컴퓨터 화면에서 관찰된 대로 빛을 카메라로 전환합니다.
컴퓨터 화면의 이미지는 현미경 접안 렌즈의 뷰에서 나온 거울 이미지입니다. 초점을 조정하여 초점 노브로 화면에서 움직이는 개별 파티클의 이미지를 선명하게 합니다. 샘플을 로드하려면 한 밀리리터의 샘플을 헹구어 낸 한 밀리리터의 투베르쿨린 주사기에 넣고 주사기를 유동 세포 덮개의 입구 포트에 부착하십시오.
출구 포트에 부착된 열린 주사기에서 유체가 분명해질 때까지 플런저를 계속 전진시키십시오. 레이저 모듈에서 공기를 정화할 수 있도록 모듈을 기울여야 합니다. 카메라 뷰에서 초점을 레이저 라인의 오른쪽으로 이동하여 균일한 수의 입자 영역으로 이동합니다.
수직 방향을 조정하여 빛의 수평 밴드를 중앙에 맞추고 가장 많은 수의 파티클이 뷰에 표시될 때까지 초점을 다시 맞춥니다. 모든 후속 조치에 대해 초점의 위치를 일관되게 유지하십시오. 카메라 뷰의 오른쪽 상단에서 어두운 정보 기호가 간헐적으로 켜고 끄는 지점으로 카메라 레벨을 조정합니다.
나노입자 추적 분석 또는 NTA의 경우 지속 시간을 30초 또는 60초로 설정하고 비디오 수를 다섯 개로 설정합니다. 기존 기본 파일 이름을 변경하려면 새 파일 이름으로 생성된 데이터에 대한 새 저장소 사이트의 탭을 클릭합니다. 그런 다음 목표 온도 상자를 선택하여 원하는 온도를 입력하고 스크립트 생성을 클릭하여 표준 측정을 재사용하십시오.
샘플이 로드되고 실험을 실행할 준비가 되면 스크립트 만들기 및 실행을 클릭합니다. 설정된 보고서 세부 정보 팝업 화면에서 연산자, 샘플 및 희석제에 대한 필요한 정보로 필드를 채웁니다. 원하는 필드가 모두 채워지면 설정 확인을 클릭하여 스크립트를 시작합니다.
각 비디오 캡처 전에 플런저를 수동으로 진행하라는 프롬프트를 찾습니다. 약 0.05 밀리리터의 샘플을 레이저 챔버에 주입하십시오. 파티클이 고정되면 [확인]을 클릭합니다. 다섯 번째 비디오 캡처를 완료하면 프로세스 상자와 함께 설정 확인 상자가 나타납니다.
프레임이 비디오 화면 하단에서 수동으로 진행되면 화면에 파티클을 만드는 파란색 십자선의 수를 기록하고 샘플 처리를 위한 감지 임계값을 설정합니다. 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시되기 전에 결과가 히스토그램에서 비디오가 자동으로 처리될 때까지 기다린 다음 확인을 누르십시오. 내보내기 설정 상자가 나타나면 내보내기를 클릭하여 결과를 저장합니다. 현재 실험에 나열된 다섯 개의 캡처 비디오를 모두 강조 표시합니다.
그런 다음 선택한 파일 처리를 클릭하고 프로세스 상자에 설정 확인 상자가 나타날 때까지 기다렸다가 깜박여 감지 임계값을 변경 한 다음 감지 임계 값을 원하는 수준으로 조정하고 설정으로 이동하여 확인을 클릭하십시오. 비디오는 결과 히스토그램에서 자동으로 처리되며 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시됩니다. 클릭 OK.In 리포좀 샘플 및 대표적인 DPBS 희석제에 대한 대표적인 분석, 나노트래킹 분석, 또는 NTA의 결과가 도시되어 있다. 여과된 샘플은 밀리리터 당 108 나노미터의 평균 입자 직경 및 7.4배 10 내지 8번째 입자의 농도를 가졌다.
대조적으로, 여과되지 않은 샘플은 밀리리터 당 159 나노미터의 평균 입자 직경 및 7.6 배 10 내지 8 번째 입자의 농도를 가졌다. 결합된 카메라 레벨에서, 검출 임계값이 두 개에서 다섯으로 증가함에 따라, 평균 및 모드 입자 크기는 여과된 샘플의 입자 크기가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 결합된 카메라 레벨에서의 입자 농도는 검출 임계값이 증가함에 따라 감소하였다.
여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이의 입자 농도에서 유의한 차이는 검출되지 않았다. 결합된 검출 임계값에서, 카메라 레벨이 12에서 14로 증가함에 따라, 필터링된 샘플의 평균 및 모드 입자 크기의 감소가 주목되었다. 결합 감지 임계값의 입자 농도는 카메라 레벨이 12에서 14로 증가함에 따라 증가했습니다.
여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 4.1~5.2단계는 올바른 보기 영역을 찾는 데 중요합니다. 여러 시험 실행에서 일관된 결과를 얻는 것은 이러한 반복 가능한 기술에 달려 있습니다.
동적 광산란은 주로 입자의 표면 전하 인 제타 전위를 얻기 위해 나노 입자 추적 분석의 동반자로 자주 사용됩니다. 나노입자 분석을 위해, NTA는 세포밖 소포 연구에 유용한 입자의 정량화의 매우 귀중한 방법이다.
