여기서, 우리는 천연 세포 내 펩티드를 보존하고, 세포및 조직에서 분해를 피하고, 동위원소 라벨링을 사용하여 펩타이드의 상대적 양에 이어 프로테아제의 빠른 열 비활성화에 기초한 교육 방법을 설명합니다. 이 라벨링 방법은 많은 장점이 있습니다. 시약은 시판되고 저렴하며 화학적으로 안정되며 단일 혈청에서 최대 5개의 샘플을 분석할 수 있습니다.
15%FBS 와 1%페니실린 연쇄상 구균신을 포함하는 DMEM에 있는 15센티미터 접시에 있는 인간 신경 모세포종 세포를 육성하는 것으로 시작합니다. 5%의 이산화탄소 하에서 섭씨 37도에서 세포를 유지합니다. PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 PBS 10 밀리리터를 추가하고 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브로 수집합니다.
원심분리기는 세포를 800배 G로 5분간 제거하고 상부체를 제거합니다. 80°C에서 매우 정제된 탈이온수 1밀리리터로 펠릿을 다시 한 번 회수한 다음 튜브의 내용물을 2밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮기습니다. 제브라피시의 열 불활성화 후, 2 밀리리터 미세 분리 튜브에서 전체 뇌를 수집하고 분석 할 때까지 영하 80도에서 동결.
80°C에서 초정화 된 산화 수의 1 밀리리터에서 조직 샘플을 다시 중단하고 1 초의 30 펄스를 사용하여 프로브로 초음파 처리하십시오. 세포 용해 또는 균질 조직을 섭씨 80도에서 20 분 동안 배양 한 다음 얼음에서 10 ~ 30 분 동안 식힙니다. 샘플 볼륨 의 각 1 밀리리터에 대해 하나의 어금니 염산 스톡 솔루션 10 마이크로 리터를 추가합니다.
20초 동안 소용돌이를 섞고 얼음에 15분 간 배양합니다. 세포 용액 또는 균주 조직을 12, 000 배 G에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 낮은 결합 단백질 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집하고 영하 80도에서 저장합니다.
물과 원심분리기로 3분 동안 2, 300회 G로 초여과 장치를 청소한 다음 초여분 장치에서 물을 폐기합니다. 상체피 미리 세척된 10킬로달톤 컷오프 필터로 피펫을 넣고 섭씨 4도에서 냉장 원심분리기에서 회전합니다. 샘플의 pH를 확인합니다.
100%의 아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 양립한 다음, 0.1%의 트리플루오로아세트산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 세척합니다. 컬럼에 샘플의 전체 부피를 적재하고 0.1%의 트리플루오로아세산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 0.15%의 트리플루오로아세트산을 단백질 저결합 미세센트심분리기 튜브로 1.8 밀리리터의 1.8 밀리리터로 열로부터 펩티드를 엘테.
30°C의 진공 원심분리기에서 샘플을 완전히 건조하고 디스플레이의 농도 시간을 모니터링합니다. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 표준 펩타이드 농도 및 샘플의 100~200마이크로리터에서 펩티드 샘플을 백색 96웰 플레이트에 재차 리페드 시료를 재중단한다.
0.2 개의 어금니 산염 버퍼의 25 마이크로 리터와 12.5 마이크로 리터의 플루오스카핀을 추가하십시오. 궤도 회전기에서 1분 동안 부드럽게 균질화합니다. 다음으로, 반응을 중지하기 위해 물 110 마이크로 리터를 추가합니다.
분광로계의 설정을 조정한 다음 판을 읽습니다. 펩타이드의 최대 25 마이크로그램을 가진 각 펩티드 샘플에 1개의 어금니 트리메틸람모늄 브로마이드의 1/10제 부피를 추가합니다. pH가 5에서 8 사이인지 확인하여 필요한 경우 염산 또는 수산화 나트륨으로 조정하십시오.
비증, 유정 포름알데히드 또는 탄소-13 의 미성수 포름알데히드의 4개의 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이를 통해 5초 동안 섞으세요. 펩타이드 시료에 시아노보로하이드라이드 나트륨 또는 중질나트륨 시아노보로하이드라이드 4마이크로리터를 첨가한다.
그런 다음 소용돌이를 통해 샘플을 5초 동안 섞습니다. 펩티드 샘플을 실온에서 2시간 동안 연기 후드에 배양하여 30분마다 소용돌이를 가합니다. 비유정, 유족, 또는 탄소-13 유정 포름알데히드 나트륨 시아노보로하이드라이드 또는 유정된 나트륨 시아노보로하이드라이드의 첨가를 반복하여 각 첨가 후 소용돌이를 가한다.
실온에서 밤새 연기 후드의 샘플을 배양합니다. 중탄산암보네이트 16마이크로리터를 넣고 소용돌이에 섞으세요. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
5%의 포름산과 소용돌이의 8마이크로리터를 추가하여 5초 간 추가합니다. 펩티드 샘플을 결합하고, pH를 2-4 사이로 조정한 다음, 이전에 설명한 바와 같이 아세토닐및 삼플루오로아세트산을 사용하여 반전된 위상 정화 컬럼에 결합된 샘플을 탈염한다. 샘플을 섭씨 30도에서 진공 원심분리기에서 완전히 건조한 다음 영하 20도에 보관하십시오.
표지된 펩타이드는 질량 스펙트럼을 사용하여 관찰된다. 적색 화살표는 각각 두 개의 서로 다른 샘플 S1과 S2 사이의 비교를 위해 두 개의 동위 원소 형태인 L1 및 L5로 표지된 상이한 펩타이드의 피크 쌍의 존재를 나타낸다. 3개의 상이한 샘플, S1, S2 및 S3에 존재하는 펩타이드의 질량 스펙트럼은 각각 L1, L3 및 L5 태그로 표지된다.
쿼드러플렉스 라벨링이 수행되었습니다. 제어 샘플 S1 및 S3은 각각 L1 및 L3로 표지되었고 두 개의 실험 샘플, L2 및 S4로 표지된 S2 및 S4와 비교하여 상당한 차이를 L4.No 관찰하였다. 동위원소 라벨링은 주어진 프로테제 또는 펩티다아제에 대한 시험관 내 의 제품에 기판을 표시하는 데 사용되었다.
신경리신 효소의 존재에서 변하지 않는 펩티드가 여기에 나타난다. 효소의 존재에서 사라지거나 감소하는 펩티드는 기질이며, 증가하는 펩타이드는 제품으로 간주됩니다. 이 그림은 세 가지 형태의 태그로 레이블이 부착된 데이터베이스 검색 엔진에 의해 수행되는 펩티드 서열을 식별하는 예입니다.
정의되기 전에, 단단한 산성화로 인한 펩티드 결합을 깨는 것을 피하기 위해 샘플이 완전히 시원하다는 것을 확인하십시오. 또한, 초여제 장치의 세척이 필수적입니다. 질량 분광법은 펩티다아제 기판을 식별하여 상이한 실험 조건과 분석 연구를 위해 펩티드를 정량화하는 훌륭한 방법입니다.
