이 프로토콜은 초해상도 현미경 검사법을 사용하며, 특히 dSTORM이라고도 하는 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법을 사용하여 회절 한계를 우회하고 3차원의 나노미터 정밀도로 전기를 시각화합니다. DSTORM의 한 가지 주목할 만한 장점은 EV의 생화학적 특성을 변화시키는 단계를 손상시키지 않으면서 빛의 회절 수준 아래에 입자를 직접 시각화하는 능력입니다. 많은 진화적으로 구별되는 바이러스는 EV 시그널링을 사용하므로 dSTORM을 사용하여 질병 바이오마커 및 진행을 위한 전기를 특성화하고 SARS-CoV2와 같은 개별 바이러스 입자를 시각화할 수 있습니다. 먼저 친화성 정제, 세포외 소포 또는 EV를 유리 바닥, 마이크로 슬라이드, 총 200 마이크로리터의 8웰 플레이트에 배치하고 섭씨 4도에서 밤새 표면에 부착할 수 있도록 합니다.
8웰 플레이트에서 기존 용액을 제거하지 않고, 1X PBS에 4%파라포름알데히드의 200마이크로리터를 각 웰의 EV 함유 용액에 추가하여 플레이트에 전기를 고정하고 플레이트가 실온에서 30분 동안 배양할 수 있도록 합니다. 조심스럽게 EV를 방해하지 않는 마이크로 파이펫파라포름알데히드와 과잉 용액을 제거합니다. 1X PBS로 EV를 세척하여 과도한 파라포름알데히드를 제거합니다.
세워 절차를 세 번 수행합니다. 초과 1X PBS를 제거합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 이미징 버퍼에서 희석된 5밀리머 프로토카테주식 디산소제 용액을 만들어 시료당 250마이크로리터의 dSTORM Bcubed 버퍼 솔루션을 준비합니다.
제조 자의 프로토콜에 따라 각에 준비 된 버퍼250 마이크로 리터를 추가하고 산화 분자를 청소하기 위해 이미징하기 전에 실온에서 20 분 동안 플레이트를 배양합니다. 전기자동차는 즉시 시각화하거나 일주일 동안 섭씨 4도에 저장할 수 있습니다. 초해상도 현미경의 보정에 필요한 구슬을 준비하기 위해 100 나노미터 마이크로스피어를 분자 생물학 등급의 물에서 0.5 %의 농도로 희석하고 파이펫 200 마이크로 리터를 유리 바닥, 마이크로 슬라이드, 8 웰 플레이트의 각 우물에 희석시하십시오.
구슬이 실온에서 1 시간 동안 우물에 정착할 수 있도록 하십시오. 기존 용액을 제거하지 않고 PBS에 4%파라포름알데히드의 200마이크로리터를 교정 비드 솔루션에 각각 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양할 수 있도록 합니다. 조심스럽게 구슬을 방해하지 마이크로 파이펫으로 파라 포름알데히드를 제거하고 1X PBS로 구슬을 세 번 세척합니다.
원고에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다. 1X PBS를 제거하고 각 웰에 준비된 버퍼 250 마이크로리터를 추가합니다. 버퍼가 시각화전에 20분 동안 앉을 수 있도록 합니다.
현미경 연결 버튼을 사용하여 3D 현미경에 연결한 후 스테이지에 아무것도 배치하십시오. 목표에 100X 오일을 추가하고 우물의 중심을 목표 위에 놓습니다. 획득 설정에서 473-및 640 나노미터 의 흥분 레이저를 켜고 보기를 클릭합니다.
3D 렌즈를 활성화하지 않고 이미지 표시 옵션에서 Photon 카운트를 클릭하여 광자 포화 설정 에서 구슬을 봅니다. 초기 레이저 파워를 473나노미터 레이저의 경우 8.4밀리와트, 640나노미터 레이저의 경우 11.6밀리와트로 설정한다. 레이저의 초점을 약 영하 300 나노미터 또는 교정 구슬의 초점 평면으로 줄여 개별 구슬의 명확한 해상도를 생성합니다.
Z-평면에 초점을 맞추면 레이저 전력 레벨을 조정하여 각 시야의 변동을 고려합니다. 계측기 기능하에서 완전한 3D 매핑 보정 및 채널 매핑 보정을 수행하여 X, Y 및 Z축의 오류를 가져옵니다. 최대 시야 필드 수를 20개로 설정하고, 대상 점 수를 4, 000으로 설정하고, 채널 간 최대 거리는 5.0픽셀로, 채널 매핑 교정 시 채널 간 제외 반지름을 10.0 픽셀로 설정합니다.
교정이 90% 이상의 포인트 커버리지와 양호한 매핑 품질을 생성하도록 합니다. 향후 이미지 수집을 위해 지정된 교정 데이터를 저장합니다. 목표에 100X 오일을 추가하고 준비된 EV를 현미경에 배치합니다.
3D 렌즈를 활성화하지 않고 640나노미터 의 외향 레이저를 켜고 처음에는 시야에서 신호의 강도에 따라 1.2~12.5밀리와트 사이로 올리며 적막을 자극하고, 교감하고, 염색된 EV를 자극한다. 이미지 표시 옵션에서 보기 메서드를 광자 채도에서 백분위수로 전환하여 TV를 더 잘 시각화합니다. 레이저 전원을 조정하여 노이즈를 최소화하고 신호를 최대화하고 다른 모든 매개 변수를 유지합니다.
Z축의 위쪽 또는 아래 쪽 아이콘을 클릭하여 Z 평면의 초점을 조정합니다. 노출 시간을 20밀리초로 설정하고, 프레임 캡처를 10, 000 프레임으로 설정하고 초기 레이저 전력은 신호 및 시야의 강도에 따라 1.2~12.5밀리와트 사이로 설정합니다. 아이콘을 사용하여 3D 렌즈를 활성화하고 획득 버튼을 클릭하여 획득을 시작합니다.
이미지 수집 프로세스 전반에 걸쳐 레이저 전력을 1000프레임마다 10개씩 3배 증가하거나 높은 신호 대 잡음 비율을 유지할 수 있습니다. 획득 하는 동안 Z-평면을 조정 하지 마십시오. 이미지 수집 후 보기 분석 창으로 전환합니다.
필터링되지 않은 이미지에서 드리프트 보정을 수행한 다음 필터를 활성화합니다. 원고에서 언급한 대로 광자 수, 현지화 정밀도, 시그마 및 프레임 인덱스를 조정합니다. 시야에서 개별 EV의 X축을 따라 X, Y, Z 평면 보기 도구를 오버레이하고 포토스위칭 이벤트의 개별 CSV 파일을 내보냅니다.
사진 스위칭 이벤트를 설정 거리 그룹으로 고정하는 Line Histogram 도구를 사용하여 XXXXXXXXXX에서 Y축을 양분합니다. 단일 EV의 이미지를 가져와 tif 파일로 저장합니다. Z축을 따라 배치에 따라 3D 시각화 도구와 색상을 사용하여 개별 EV의 3D 비디오를 만듭니다.
Z축에서 X, Y축 및 38나노미터에서 평균 오차 16나노미터를 생성한 현미경보정에 따라 정제된 u20s EV는 Z축을 따라 X, Y축 및 50나노미터에서 최대 20나노미터의 해상도로 성공적으로 시각화되었다. 레이저 전력이 증가함에 따라 10, 000 프레임 노출을 통해 전환된 3D 포토로 dSTORM을 통해 시각화된 개별 EV는 획득된 이미지에서 쉽게 명백해졌습니다. Z 평면의 수집 후 이미지 보정, 광자 수, sigmas 및 재구성된 이미지의 현지화 정밀도는 3D에서 EV를 명확하게 해상도로 생성했습니다.
EV 포토는 오른쪽 상단 모서리의 전설에서 볼 수 있듯이 처음 7, 000 프레임 에서만 전환되었습니다. 히스토그램은 대부분의 포토스위칭 이벤트가 100나노미터 반경 내에서 발생했으며, 시각화된 EV가 엑소좀이고 직경이 작은 EV의 분리가 성공적이었다는 것을 확인합니다. 라인 히스토그램 도구와 X, Y, Z-평면 보기 도구를 사용하여 다른 개별적으로 추적된 EV에서 수행된 크기 분포 분석은 대부분의 포토스위칭 이벤트가 중심의 100나노미터 반경 내에서 발생한다는 것을 확인했습니다.
Z축을 따라 오류가 증가하여 축축을 따라 EV의 길쭉한 최종 이미지를 생성했습니다. 포토스위칭 이벤트는 EV 크기와 상관관계가 없으며, dSTORM 기반 특성화는 직경 이 100나노미터 미만의 작고 용제바이러스와 같은 소형 EV에 사용될 수 있음을 입증했습니다. dSTORM을 수행하는 동안 초기 레이저 전력을 매우 낮게 설정하고 광표백을 방지하기 위해 이미지 수집 전반에 걸쳐 천천히 올리는 것이 중요합니다.
개발 이후 DSTORM은 연구원들이 이전에는 일반적인 광 현미경 검사법의 회절 제한으로 인해 시각화가 불가능했던 하위 세포 구조의 형태를 더 잘 이해할 수 있게 해 주었으며, 이는 연구자들이 이를 통해 더욱 잘 이해할 수 있게 해 주었으며, 이는 일반적인 광 현미경 검사법의 회절 제한때문입니다.
