이 프로토콜은 조각화된 기본 리드 검색 캠페인에 유용한 것으로, 유망한 조각을 열 후보로 선택하는 추가 도구입니다. 단편 스크리닝을 위한 나노 DSO는 표지되지 않은 단백질 샘플의 제한된 양을 사용하며 거의 모든 단백질 표적에 일상적으로 사용될 수 있습니다. 이 메서드는 모든 리간드 컬렉션을 스크리니스트하는 데 사용할 수 있습니다.
또는 다른 메서드에서 열을 확인 합니다. 영하 20도 또는 영하 80도 냉동고에서 조각판을 꺼내 벤치 탑 셰이커에 부드러운 흔들림으로 실온에서 해동하십시오. 30초 동안 500배 G로 플레이트를 원심분리하여 우물 측면에 달라붙는 방울을 수집합니다.
다중 채널 파이펫을 사용하여 단백질 스톡 용액의 MRC 2웰 결정화 플레이트및 파이펫 15 마이크로리터를 각 서브에 넣습니다. 모기에 단편 및 단백질 플레이트 정의를 확인하려면 나노 디스펜서를 켜고 움직이는 구성 요소 주위에 장애물이 없는지 확인하십시오. 그래픽 사용자 인터페이스를 열고, 설치 탭을 클릭하고 데크 구성 에서 화합물이 공급되는 플레이트의 종류와 단백질이 전송되는 플레이트의 종류가 사용 가능한 플레이트 목록에 이미 존재하는지 확인합니다.
그렇지 않은 경우 옵션 과 플레이트를 클릭하고 속성 유형에 대한 올바른 값을 작성하여 새 플레이트 정의를 만듭니다. 설치 탭에서 데크 구성 아래에 플레이트 위치를 지정합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 1위및 MRC 2웰 플레이트에 대한 Grainier U 하단 플레이트를 선택하여 2위를 지정하고 프로토콜을 저장합니다.
조각판을 1개 에 배치하고 단백질 플레이트를 데크 2위치에 놓습니다. 프로토콜 탭에서 파일을 클릭하고 조각을 분배하기 위해 이전 단계에서 저장된 프로토콜을 선택합니다. 분전할 조각의 부피를 0.3 마이크로리터로 정의합니다.
열 1과 12가 조각을 포함하지 않는 일반적인 플레이트의 경우 조각이 포함되어 있지 않고 시작 위치를 열 2로 정의하고 끝 위치는 열(11)으로 정의합니다. 일부 플레이트에서는 열 2개 또는 11개가 비어 있는 경우 열을 3개와 10개를 시작 및 끝 값으로 사용합니다. 프로그램을 시작하려면 실행을 클릭합니다.
약 2분이 걸리는 디스펜싱 후 로봇의 단백질과 조각판을 제거하고 접착제 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 단백질 플레이트를 500배 G에서 30초 동안 간략하게 원심분리하여 다음 단계로 진행하기 전에 우물 측면에 달라붙는 방울을 수집합니다. 단편의 첨가로 인해 발생할 수 있는 강수량에 대한 단백질 플레이트의 우물을 육안으로 검사합니다.
많은 우물에서 강수량이 관찰되면 조각의 농도를 줄이고 실험을 반복하십시오. 프로메테우스 기기를 켭다. 터치 스크린에서 오픈 서랍을 눌러 계측기의 모세관 적재 모듈에 액세스합니다.
로딩 모듈에서 마그네틱 스트립을 제거하고 에탄올로 미러를 청소하여 먼지 입자를 제거합니다. 단백질 단편 플레이트에서 모세 혈관으로 용액을 전달하려면 단백질 플레이트와 모세 혈관을 계측기 옆에 배치하여 모세관 적재 모듈에 쉽게 접근할 수 있습니다. 한쪽 끝에 그것을 들고 있는 한 모세관을 취하고 시료를 전송하기 위하여 모세관의 다른 쪽 끝으로 단백질 판에 있는 용액을 터치합니다.
항상 장갑을 착용하고 장갑의 불순물이 측정에 영향을 미치기 때문에 중간에 모세관을 만지지 않도록하십시오. 모세관을 홀더의 지정된 위치에 배치하여 제대로 정렬되고 중앙에 배치하고 이러한 단계를 반복하여 로딩 모듈의 모든 위치를 채웁니다. 마지막에, 모세 혈관 의 상단에 자기 스트립을 배치장소에 그들을 잡고 나노 DSF 실험을 시작하기 위해 닫기 서랍을 누릅니다.
프로메테우스 응용 프로그램 PR을 엽니다. ThermControl 및 새 세션 시작을 클릭하여 새 프로젝트를 만듭니다. 먼저, 샘플의 형광을 감지하기 위해 발견 스캔을 수행합니다. 레이저의 흥분 력을 조정하여 샘플의 형광 신호를 변경합니다.
열 성하를 위해, 녹는 스캔 탭을 클릭, 20섭씨, 최종 온도95섭씨, 온도 경사를 분당 섭씨 1도로 설정합니다. 그런 다음 측정 시작을 클릭합니다. 외식, 운동성 또는 암에서 높게 발현되는 변속 온도의 주파수 분포는 모노폴라 스핀들 키나아제 1의 조절테트라트리코파티드 반복 도메인, 및 SARS-CoV-2 3c-3c-like protease를 도시한다.
음수 값은 조각이 있는 상태에서 용융 온도가 감소했음을 나타내며, 양수 값은 용융 온도의 증가를 나타냅니다. Nsp5의 경우 모든 조각은 안정화 효과가 있는 반면 Hec1및 Mps1의 경우 안정화 및 안정화 타격이 모두 관찰됩니다. 이것은 조각 라이브러리를 선별하는 저렴하고 빠른 방법입니다.
NMR 또는 X 선 결정학과 같은 다른 방법은 조각의 정확한 결합을 보여줄 수 있으며 INX 발견을 통해도 사용할 수 있습니다. 코로나바이러스 프로테아제의 결과는 COVID-19에 대하여 약으로 발전할 수 있는 새로운 화합물을 제안하는 것을 도왔습니다.
