안녕하세요,이 JoVE"비디오에 오신 것을 환영합니다. 리즈에서 개발 중인 시간 해결 연구인 빠른 그리드 제작을 위해 여기에 있는 설정을 소개하고 싶습니다. 이것은 표준 시스템이 아니라는 점에 유의하십시오, 그러나 우리는 당신에게 우리가하는 모든 일과 매개 변수에 대한 자세한 설명을 제공함으로써, 당신은 당신의 자신의 실험실에서 유사한 시스템을 개발할 수 있기를 바랍니다.
장치에 대한 자세한 설명은 리치몬드 프로토콜에 제공됩니다. 여기에서빠른 그리드 준비 및 시간 해결 EM을 위한 단계별 가이드를 제공할 것입니다. 우리의 경험에서, 단백질 농도 밀리 리터 당 2 밀리 그램 이상 이어야 한다. 이 프로토콜에는 최소 50마이크로리터가 필요합니다.
장치를 켭니다. 그런 다음 제어 PC를 켜고 제어 소프트웨어를 시작합니다. 각 주사기 펌프의 초기화 버튼을 눌러 모든 주사기 펌프를 초기화합니다.
강력한 전원 공급 장치를 켜고 9볼트로 설정하고 오실로스코프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 가압 질소 가스는 스프레이를 생성하기 위해 필요합니다. 질소 실린더를 열고 압력을 2 막대로 설정합니다.
모든 주사기 펌프 밸브가 부하 위치에 있는지 확인합니다. 이렇게 하려면 모든 밸브를 전환하여 제어 소프트웨어에서 디스펜스한 다음 다시 로드합니다. 모든 주사기를 0으로 설정합니다.
시스템에 존재하는 모든 기포는이 단계에서 제거해야합니다. 이렇게하려면 주사기는 나사를 풀고 거품을 수동으로 제거하고 주사기가 더 이상 거품을 포함하지 않을 때 다시 장착되어야 할 수 있습니다. 액체 처리 시스템은 일반적으로 물에 저장됩니다.
샘플을 로드하기 전에 시스템은 버퍼로 평형화됩니다. 이것은 버퍼의 초과와 튜브를 세척하여 이루어집니다. 적어도 200 마이크로리터의 버퍼가 포함된 튜브를 주사기 에 놓습니다.
튜브 의 상단을 부착하려면 관통해야합니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 주사기로 50~100마이크로리터 사이의 적절한 양의 버퍼를 흡인합니다. 밸브 를 전환하여 분배합니다.
모든 액체를 주사기에 분배합니다. 밸브를 하중 위치로 반환하고 주사기의 초기화 버튼을 눌러 다음 세척 주기를 위한 시스템을 준비합니다. 이 단계는 일반적으로 튜브의 철저한 세척을 보장하기 위해 세 번 반복됩니다.
다음으로 스프레이 노즐이 배치됩니다. 급락하는 팔에 EM 그리드를 놓습니다. 스프레이 노즐 앞에 그리드를 배치합니다.
제어 소프트웨어를 사용하여 버퍼를 분배합니다. 노즐과 그리드가 정렬되면 장시간 분사 한 후 액체가 축적되어야합니다. 필요한 경우 노즐 위치를 조정한 다음 그리드에 액체가 축적되는 위치를 다시 확인합니다.
다음으로, 에탄 컵의 위치를 조정합니다. 핀셋의 끝은 에탄 컵의 중앙에 대략 도달해야합니다. 모든 설정이 올바른지 확인하기 위해 테스트 실행을 수행합니다.
습도 챔버를 닫습니다. 플런저경로가 명확한지 확인합니다. 단일 실행에 필요한 버퍼 의 볼륨을 주사기 로 흡인합니다.
밸브 를 전환하여 분배합니다. 제어 소프트웨어에서 run'in을 눌러 실행을 시작합니다. 주사기 펌프 하나가 이동하고 이 경우 2초 동안 그리드가 적절한 지연 후 1.5초 후에 급락하는지 확인합니다.
실행이 완료되면 플런저 암의 압력을 원하는 값으로 설정합니다. 제어 소프트웨어를 눌러 급락하는 팔에서 압력을 해제합니다. 이제 에탄 컵은 시원하고 액체 에탄으로 채워져 있습니다.
사용하기 전에 그리드를 글로우 방전합니다. 일반적인 광선 배출은 0.1 밀리바 공기에서 10 밀리암페어에서 90초입니다. 그런 다음 튜빙을 샘플로 평가합니다.
사용 가능한 샘플 볼륨이 낮으면 튜브가 하나의 데드 볼륨으로 만 평형화 될 수 있습니다. 흡인 샘플. 일반적으로 죽은 부피는 약 30 마이크로 리터입니다.
밸브 를 전환하여 분배합니다. 튜빙과 노즐을 통해 샘플을 분배합니다. 그런 다음 단일 실행에 필요한 샘플의 양을 흡인합니다.
밸브 를 전환하여 분배합니다. 상대 습도가 원하는 값에 도달했는지 확인합니다. 우리는 일반적으로 60 % 이상에서 그리드를 준비합니다.
이 시간은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 핀셋을 급락하는 팔에 빛 배출 그리드를 들고 놓습니다. 전위요미터 슬라이드를 시작 위치에 배치하여 속도 측정을 준비합니다.
오실로스코프 소프트웨어에서 속도 측정을 위한 트리거를 설정합니다. 액체 에탄 컵을 놓고 습도 챔버에 가깝습니다. 플런저경로가 명확한지 확인합니다.
제어 소프트웨어에서 실행을 시작합니다. 실행이 완료되면 제어 소프트웨어OK'in을 눌러 급락하는 팔에서 압력을 방출합니다. 습도 챔버를 열고 급락 팔과 핀셋 사이의 연결을 느슨하게.
액체 에탄에 그리드를 유지하면서 급락 팔을 위로 이동합니다. 그런 다음 그리드를 액체 질소로 전송하고 저장합니다. 오실로스코프 측정을 저장합니다.
수동으로 전위오미터 슬라이더와 플런저의 위치를 재설정합니다. 프로토콜을 반복하여 복제 그리드를 준비합니다. 시간 해결 된 실험은 비슷한 방식으로 수행됩니다.
혼합 단계에서 희석으로 인해 시간 해결 실험에 더 높은 재고 농도가 필요합니다. 시간 해결 된 실험의 경우 세 주사기를 모두 사용하십시오. 튜빙은 주사기 펌프와 스프레이 노즐에 부착되어 있습니다.
여기에 사용되는 미세 유체 스프레이 노즐에는 혼합 요소가 포함되어 있습니다. 더 긴 튜브는 더 큰 데드 볼륨을 제공하고 평형 단계를 세척하려면 더 많은 버퍼와 샘플이 필요합니다. 버퍼와 샘플을 별도로 모든 주사기를 상화합니다.
일반적으로 주사기 1개는 샘플 A'와 주사기 2개 및 3개 샘플 B'에 사용되며, 튜빙이 평형화된 후, 샘플 A를 주사기 1개에 로드하고 B를 주사기 2개와 3개로 채점한다. 그런 다음 밸브를 1~3번 전환하여 분배합니다. 제어 소프트웨어에서 실행을 시작합니다.
시간 해결 된 실험에 다른 실행 스크립트가 필요합니다. 다른 시간 지연은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다. 플런저 속도를 조정함으로써 혼합에서 동결까지의 시간 지연을 변경할 수 있습니다.
빠른 급락 속도는 더 짧은 시간 지연으로 이어질 것입니다. 또는 스프레이 노즐의 수직 위치를 조정하여 스프레이 에탄 거리가 변경됩니다. 거리를 늘리면 시간이 길어집니다.
낮은 배율에서 전자 현미경에서, 전형적인 그리드는 이렇게 보입니다. 표시된 대로 얇은 얼음 영역은 데이터 수집에 적합합니다. 배율이 높을 때 파티클은 명확하게 표시되어야 합니다.
아포페리틴과 같은 테스트 시편을 사용하면 단일 그리드에서 비교적 작은 데이터 집합이 3~4개의 협스트롬 해상도로 재구성하기에 충분합니다. 시간 해결 실험의 경우 서로 다른 시간 포인트 또는 그리드에서 데이터 집합을 수집합니다. 3D 분류를 위해 데이터를 결합한 다음 파티클을 시간점으로 다시 추적하는 것이 유용합니다.
이렇게 하면 데이터가 반응 역학에 대한 구조적 정보와 정보를 제공할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 당신이 비디오를 즐겼으면 좋겠다. 우리는 비디오와 함께 JoVE 논문의 자세한 설명과 함께, 당신은 돌연변이에서 문제의 일부를 완화하거나 공기 물 인터페이스에서 상호 작용을 돕기 위해 보여 진 빠른 그리드 제작을 통해 자신의 실험을 수행 할 수 있기를 바랍니다, 당신이 시도하고 그 비 평형 상태의 일부를 트랩하기 위해 자신의 시간 해결 연구를 수행하는 데 필요한 모든.
그래서, 행복 그리드 만들기.
