Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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단백질 발현, 정제 및 결정화 실험은 오크 리지 국립 연구소의 미국 에너지 생물 및 환경 연구 사용자 시설인 구조 분자 생물학 센터(CSMB)에서 수행되었습니다. 중성자 회절 데이터는 미국 에너지부 기초에너지과학부 과학사용자시설부(ORNL)의 스Pallation 중성자 출처(SNS)에서 BL-11B MaNDi에서 수집되었습니다. 저자는 데이터 감소에 대한 도움을 브렌던 설리반 감사합니다. X선 회절 데이터는 노스캐롤라이나 주에서 지원하는 노스캐롤라이나 주립 대학의 분자 교육, 기술 및 연구 혁신 센터(METRIC) 시설에서 수집되었습니다. GCS는 ORNL에서 국립 연구 재단 (NRF), 남아프리카 공화국 및 대학원 기회 (GO!) 프로그램에서 부분적으로 지원을 인정합니다. FM은 USDA NIFA 해치 211001 지원을 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

중성자 단백질 결정학은 단백질에서 프로토네이션 상태와 물 분자 방향을 조사하는 매우 민감한 기술입니다. 이 정보는 프로토네이션과 수소 결합 상호 작용의 변화가 종종 효소 화학10의 중심이기 때문에 단백질 촉매 메커니즘에 빛을 비추는 경우가 많습니다. 중성자 단백질 결정학은 유익한 기술이기는 하지만 중성자 회절 실험을 수행하기 전에 고려해야 할 여러 가지 요인이 있습니다.
<ol><li>데이터 수집을 위한 대형 단백질 결정의 요구 사항입니다.</li>
	<li>수소 및 금속 이온과 같은 기타 원소의 산란 특성.</li>
	<li>단정된 샘플로 작업할 때 구조 개선 및 모델 구축 소프트웨어의 제한사항입니다.</li>
</ol>중성자 단백질 결정학은 플럭스 한정 기술이다. X선 회절 데이터 집합과 는 달리, R-팩터가 높고 완전도가 낮으며, 중복성 및 신호 대 잡음 비율은 고유한 제한(플럭스 제한, 준 라우, 긴 파장)으로 인해 중성자 데이터 집합에 대해 예상됩니다. 단일 프레임의 데이터 수집은 일반적으로 12 - 18 시간입니다. 실험의 성공은 샘플 크기와 품질에 크게 좌우되며, 크리스탈은 0.1 mm3의 경우가 종종 최소 요구 사항3입니다. 중성자 회절은 10에서 800 μL에 이르는 결정화 방울을 설정하기 위해 다량의 단백질생산을 요구합니다. 충분히 큰 결정을 성장하기위한 최소 부피는 결정 및 샘플 매개 변수 (https://neutrons.ornl.gov/imagine)를 감안할 때 볼륨 계산기를 사용하여 추정 될 수있다. 큰 결정의 성장은 가장 널리 증기 확산에 의해 달성되었다3. 매달려 있는 낙하 결정화는 10-25 μL에 이르는 큰 방울에서 결정의 성장을 허용하며, 최대 ~ 50 μL에 이르는 더 큰 방울은 시판 가능한 착하 장비14,54를 사용하여 설정할 수 있습니다. 실리콘 9웰 유리 플레이트는 최대 800μL의 부피를 사용하여 매우 큰 방울을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 유리 판은 햄프턴 연구에서 시판되는 "샌드위치 상자"에 배치됩니다. 추가 결정화 기술은 배용기에 의해 낙하 크기의 한계가 결정되는 배치 결정화를 포함한다. 배치 결정화 실험은 마이크로리터에서 밀리리터55까지 다양할 수 있습니다. 결정화는 또한 단백질이 투석막을 통해 침전제와 평형되는 투석 기술을 사용하거나 침전성 농도 그라데이션을 따라 또는 아가로오스56,57과 같은 다공성 플러그를 통해 역확산에 의해 수행될 수 있다. 시드는 원하는 부피의 결정을 얻기 위한 또 다른 대안을 제공합니다. 마이크로 및 매크로 시드는 NcLPMO9D45의 큰 크리스탈을 포함하여 큰 결정 성장을 위해 성공적으로 채택되었습니다. 용해도에 대한 온도의 영향을 포함하여 단백질 상 다이어그램에 대한 일부 지식은 큰 결정 성장에 도움이 됩니다.
중성자 회절 실험을 계획할 때, 회절 데이터 수집 시 신호 대 잡음 비율을 최대화하기 위한 단백질 제제의 최적화가 필수적이다7. H 원자에 의한 밀도 취소및 높은 일관성 있는 산란을 우회하기 위해, 중성자 SLD 지도는 양극성 산란 길이와 낮은 일관성 산란 길이를 가진 동위원소 D에 H 원자를 교환하여 개선될 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 중수소 결정화 완충제에 대한 수소단백질 결정의 증기교환이 수행된다. 이를 통해 용매 분자와 비열성, 틸트라테이블 단백질 H 원자23의 H/D 교환을 보장합니다. 증기 교환은 D2O 기반의 결정화 버퍼 "플러그"를 사용하여 석영 모세관에 수소화 결정을 장착하여 수행되며 가장 자주 적용되는 효과적이고 부드러운 기술을 나타냅니다14,23,35. 교환은 몇 주가 걸릴 수 있으며 바람직하게는 최대 H/D 교환을 보장하기 위해 중음 버퍼를 자주 변경해야합니다. H/D 교환은 또한 결정화 된 버퍼에 직접 침전시킴으로써 수행 될 수있다. D2O 노출로 인한 응력 하에 결정을 두지 않으려면 D2O:H2O 비율을 점진적으로 증가시킴으로써 침을 흡수 공정을 점진적으로 수행해야 합니다58. 이 외에도, 수소화 단백질의 결정화는 또한 음순 H 사이트에서 H/D 교환을 위한 유정완에서 수행될 수 있다22,59. 그러나 D2O 기반 완충은 알려진 H2O 기반 조건3,59의 추가 조정을 요구하는 단백질 용해도에 영향을 미친다는 점에 유의해야 한다. D2O 기반 버퍼는 또한 어떤 경우에는 더 작은 결정으로 이끌어 내는 관찰되었습니다59. 정족성 및 탄소바운드 H 원자를 D로 완전히 교환하면 유족 매체에서 단백질을 발현하여 정해각된 시료20을 생성함으로써 달성될 수 있다. 결과 중성자 SLD 맵은 감전된 시료의 크게 향상되고, 더 이상 수소화시 샘플의 밀도 취소를 표시하지 않는다. 이것은 단백질 또는 공동 인자에 있는 교환할 수 없는 사이트에 H/D 바인딩을 특성화할 때 유익합니다. 그러나, 변성 단백질의 발현은 비용이 높고 수율60이 낮다. 오크 리지 국립 연구소 (ORNL) 구조 분자 생물학 센터 (CSMB) perdeuterated 샘플을 생성 하고자 하는 사용자를 위한 중성 시설 (https://www.ornl.gov/facility/csmb). 전형화된 발현은 전형적으로 정제된 단백질61의 50 mg을 산출하는 1 L 스케일에 대한 생물 반응기에서 수행됩니다.
중성자 회절 데이터의 수집에 따라 개선 및 대화형 모델 구성이 수행됩니다. 페닉스.refine, nCNS 또는 SHELXL28,31,32,33을 포함한 여러 소프트웨어 제품군을 사용하여 개선이 실행될 수 있습니다. Phenix 제품군은 중성자 SLD maps34에서 모델을 수동으로 빌드하는 데 사용되는 Coot와 함께 중성자 회절 데이터를 구체화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 소프트웨어입니다. Phenix와 Coot 모두 중성자 회절 데이터의 처리를 허용하지만 중성자 데이터 및 증식 샘플과 관련된 특이성을 처리하는 데 필요한 특정 기능이 부족할 수 있습니다. 예를 들어, Coot는 "실제 공간 정제"기능은 "폭발"잔류물 (보충 도 26)62결과 때문에 모델 빌드 중에 합병증으로 이어질 수있는 미결 잔류물에 대한 기하학적 최적화를 포함하지 않습니다. 이 문제는 모든 증단된 잔류물에 대한 구속 파일을 생성하여 해결할 수 있습니다. 그러나 이것은 집중적인 프로세스이며 이러한 라이브러리는 현재 공개적으로 사용할 수 없습니다. Phenix에서 세련미를 수행할 때 교환 가능한 H/D 사이트는 처음에는 H 및 D의 0.50 점유율로 설정됩니다. 정교함이 수행됨에 따라 H와 D의 점유율은 중성자 SLD 맵에 따라 개선됩니다. 대화형 모델 구축 중에 차이 밀도 Fo-Fc 맵은 H/D 점유율을 평가하는 데 매우 유익합니다. 지도는 높은 D 점유율을 가진 사이트를 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 이는 프로토 네이션 상태가 촉매 적으로 관련되는 활성 사이트에서 특히 유익하다63. 그러나 H:D가 모호한 상황이 발생합니다. 점유율은 0.70:0.30에 가까우며 중성자 SLD 맵64에서 완전한 신호 가취소됩니다. 또한 준 라우에 중성자 데이터 세트는 종종 약 80 %의 완전성을 가지고 있다는 것을 고려해야하며, 이는 X 선 회절 데이터에 대해 일상적으로 관찰 된 ≥ 98 %보다 낮습니다. Phenix에서 중성자 회절 데이터를 정제할 때 누락된 관찰된 진폭(Fo)은 모델에서 계산되어 반사 목록을 완료하여 모델 바이어스를 도입합니다. 이러한 잠재적 편향 "no_fill" 맵을 고려하려면 대화형 모델 빌드 중에 "채워진" 맵이 아닌 검사해야 합니다.
사용자는 구조의 조인트 X 선/중성자 데이터 구체화 또는 중성자 데이터만 구체화하도록 선택할 수 있습니다. 특히 낮은 해상도의 중성자 SLD 맵을 시각화하는 것은 H/D 증기 교환에도 불구하고 교환할 수 없는 사이트에 H가 여전히 존재하는 수소 단백질에 대해 특히 당황스러울 수 있습니다. 이로 인해 중성자 밀도 맵이 취소되어 불연속 맵65,66의 인상을 줍니다. 해당 X선 데이터 집합을 수집하는 것은 공동 개선에서 이러한 취소를 유리하게 보완합니다(그림 13A 및 도 13B). 관절 정제 전략은 일반적으로 X 선 데이터에 대한 단백질 백본 좌표를 정제하는 것을 포함하며 중성자 회절 데이터는 교환 가능한 사이트에서 H/D 원자의 위치와 점유율을 구체화하는 데 사용됩니다28. 교환 가능한 사이트에 조인트 H/D 점유율을 도입하면 구체화되는 매개 변수의 수가 증가하므로 X선 데이터와의 관절 개선도 데이터 대 매개 변수 비율을 증가시킵니다. 조인트 정제는 동일한 결정 또는 동일한 조건하에서 자라는 결정에서 동일한 온도로 수집되는 해당 X선 데이터 집합을 필요로 합니다. 실온(300K)에서 수집된 중성자 회절 데이터의 경우, 해당 X선 데이터 세트는 방사선 손상을 제한하기 위해 저용량 데이터 수집 전략을 사용하여 실온에서 수집되어야 합니다. 반면, Perdeuterated 샘플은 H/D 신호 취소의 동일한 크기를 가지고 있지 않기 때문에 개선되고 연속적인 중성자 SLD 맵을 제공합니다. 그러나, 금속과 황을 포함한 특정 원소의 중성자 산란 길이는 단백질이 멸폐된 경우에도 중성자 SLD 맵에서 제대로 보이지 않게 만든다(도 13C-F)18. 금속을 특성화해야 하는 경우, 관절 미세 조정에서 X선 회절을 활용하거나 회절 실험을 보완하기 위해 분광 기술을 적용하는 것이 가장 좋습니다. 중성자 전용 데이터 정제는 중성자 데이터 세트가 고해상도를 가지고 있거나 perdeuterated 단백질을 사용할 때 종종 수행됩니다. 또한, 중성자 전용 데이터 정제는 방사선 손상에 매우 민감한 단백질이 연구되고 있는 경우 특히 유용하며, X선 유래 구조는 방사선 유발 유물을 보유할 수 있기 때문입니다. 중성자 데이터 전용 구체화를 수행하려면 해당 중성자 데이터 집합에 충분한 완전성과 해상도가 있는지 확인해야 합니다.
ORNL은 중성자 회절 데이터 수집을 위한 두 가지 시설을 제공합니다: HFIR의 IMAGINE 빔라인과 SNS36,67의 MaNDi 빔라인. 두 계측기 모두 유사한 원리를 사용하는 중성자 회절 데이터 집합을 수집하는 효과적인 수단을 제공하지만, 각 계측기는 빔 시간을 신청할 때 고려해야 할 고유한 사양을 가지고 있습니다. IMAGINE은 준 Laue 데이터를 수집하고 최대 ~ 100 Å의 단위 셀로 결정의 실온 데이터 수집에 최적화되어 있습니다. MaNDi는 최대 ~ 300 Å의 단위 셀이있는 결정에 TOF-Laue 컬렉션을 사용하는 실온 및 극저온 데이터의 수집에 사용할 수 있습니다. 완전한 데이터 집합을 수집하기 전에, 결정이 단일 프레임에 대한 중성자 빔에 노출되는 얻어진 회절 패턴의 품질을 평가하기 위해 크리스탈에서 시험이 수행됩니다. 결정이 충분한 품질인 경우, X선 데이터 처리와 유사한 공정에서 전체 중성자 회절 데이터 집합을 수집, 인덱싱, 통합, 스케일링 및 병합합니다. IMAGINE은 라우에겐과 Lscale 및 MaNDi를 사용하여 맨티드 패키지를 사용하고 3차원 프로파일 피팅48,50,51,68,69,70을 사용합니다. 이러한 시설 중 하나에서 사용자가 되는 과학자는 추가 분석을 위해 MTZ 또는 HKL 형식으로 데이터 집합을 제공합니다.
중성자 회절은 생물학적 거대 분자의 대영 상태 및 수소 결합 상호 작용을 조사하기위한 비 파괴적이고 매우 민감한 기술입니다. 그것은 특히 사진에 민감한 단백질과 금속 단백질에 대 한 유용. 실험을 수행하기 전에 기술및 데이터 처리에 관한 몇 가지 고려 사항을 고려해야하지만, 결과는 관심있는 단백질의 촉매 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 줄 수있는 결과를 산출합니다. 중성자 단백질 결정예학은 전산, 구조, 생화학 및 분광 연구를 보완하여 생물학적 거대 분자를 특성화하는 데 사용되는 생물학자의 도구 상자에서 귀중한 도구입니다.

중성자 대분자 결정학은 단백질의 구조와 근본적인 화학에 독특한 창을 제공하는 기술입니다. 개념적으로 X선 회절과 유사하게 중성자 회절은 거세 분자 구조의 원자학적 세부 사항을 제공하지만, 중성자와 핵의 상호 작용은 종종 X 선 회절로 감지하기 어려운 빛 원자의 국소화를 가능하게합니다. X선 회절 동안 X선은 전자 구름에서 흩어져 있어 수소(H)와 같은 가벼운 원자가 서브-Ångström 해상도2 근처에 없는 전자 밀도 맵에서 제대로 보이지 않게 됩니다. 대조적으로, 중성자의 산란 강도는 다른 산란 길이를 표시하는 동일한 요소의 동위원소와 핵과의 복잡한 상호 작용에 따라 달라집니다. 따라서, 수소(1H) 및 중수소(2H 또는 D)와 같은 가벼운 원자와 동위원소는 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵에서 중추 탄소, 질소 및 산소 원자에 대한 유사한 가시성을 갖습니다. 더욱이, 중성자 산란의 크기는 전자의 수와 무관하기 때문에, 광원으로부터 산란하는 것은 X선 산란에서 관찰되는 바와 같이, 서로 가까이에 있을 때 무거운 원소에 의해 가려지지 않는다. 중성자 회절을 사용할 때 H와 동위원소 D의 향상된 가시성은 촉매적으로 중요한 잔류물, 공동 요소 및 리간드의 프로토네이션 상태에 대한 귀중한 정보를 제공하고 물 분자의 방향을 돕고 촉매 메커니즘 및 단백질 화학에 대한 중요한 정보를 드러냅니다3. 중성자 회절은 또한 비파괴 적 기술인 이점을 제공하며, 특히 금속 센터 또는 감광성 Redox cofactors2를 가진 단백질과 같은 이온화에 민감한 생물학적 샘플에 특히 적합하다는 이점을 제공합니다. 이 문서의 주요 초점은 고품질 중성자 단백질 결정 구조를 얻기 위해 워크플로우에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 우리는 중성자 단백질 회절및 Ashkar 등 al.7의 훌륭한 개요를 위해 Podjarny 외.4, 블레이클리 5, 블레이클리 외.6 및 O'Dell 외.3에 관심있는 독자를 참조합니다.
중성자는 주로 원자로 원천의 핵 분열 또는 가속기 기반 소스8의 접합이라는 두 가지 공정 중 하나를 사용하는 핵 반응 중에 생성됩니다. 원자로 공급원은 235U 동위원소의 핵핵을 채택하여 연속 중성자 빔을 제공하며, 스환화 중성자 소스는 대상, 예를 들어 수은과 같은 액체 금속, 양성자9를 통해 표적을 포격하여 펄스 중성자 빔을 생성한다. 테네시 주 오크 리지에 있는 오크 리지 국립 연구소(ORNL)는 하이 플럭스 동위원소 원자로(HFIR)와 60Hz 펄스 소스에서 안정된 상태 중성자 소스를 모두 보유하고 있습니다(SNS). HFIR에 위치한 IMAGINE 빔라인은 생물학적 거대 분자에 최적화된 중성자 디프라토계(보충 도 1)10입니다. IMAGINE은 중성자 이미지 플레이트 검출기를 사용하여 단위 셀 가장자리가 있는 단일 결정에서 2.8 - 4.5 Å 범위의 좁은 밴드패스를 사용하여 준 라우 데이터를 측정합니다 <150 Å. SNS에 위치한 거대 분자 중성자 디프라토미터(MaNDi)는 구형 검출기 어레이 프레임(DAF)(보충 도 2)11을 장착한 비행 시간(TOF) 라우중성자 디프라토계이다. MaNDi는 2.0 ~ 6.0 Å12 사이의 튜닝 가능한 2 Å 파장 대역폭을 사용하여 10 - 300 Å 범위의 단위 셀 가장자리가있는 단일 결정의 데이터를 측정합니다.
중성자를 생성하는 과정은 에너지 집약성이 높으며, 싱크로트론 소스13에서 X선 빔 플럭스와 대조될 때 상대적으로 약한 중성자 빔 플럭스를 생성합니다. 데이터 수집 중에 충분한 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 적절한 크기와 품질의 결정을 키워야 합니다14. 일반적으로 0.1 mm3의 부피가 > 있는 결정은 적절한 통계15로 데이터를 수집하는 데 필요합니다. 낮은 유동성 이외에, 중성자와 시료 핵 사이의 상호 작용의 고유 한 특성을 고려해야합니다16. 중성자의 산란 길이는 동일한 요소의 동위원소에 대해 다르며, 작은 각도 중성자 산란(SANS)에서 유리하게 활용될 수 있는 특성으로 시료의 영역을 마스크하거나 강조하여 대조 매칭17로 알려져 있다. 회절 실험에서, 음의 일관된 중성자 산란 길이 H(-3.741 fm for 1H)는 탄소(6.6511 fm), 질소(14N 산소용 9.37fm), 질소(9.37 fm) 등 생물학적으로 관련된 원자의 일관된 중성자 산란 길이 이후 중성자 산란 밀도 맵 기능의 취소로 이어질 수 있다. 인(31P용 5.13 fm)과 유황(32S용 2.804 fm)은 양성(표 1)12,14이다. 또한 H(25.274 fm)의 큰 분산 길이는 데이터 수집 중 배경을 증가시켜 데이터 집합의 품질을 저해하고 데이터 해상도7을 손상시킵니다. H에 의해 도입 된 이러한 한계를 회피하기 위해, 중성자 회절에 대한 H를 교환할 필요가, 2H (D), 이는 긍정적 인 일관된 중성자 산란 길이 (6.671 fm) 상당히 낮은 일관성 산란 길이 (4.04 fm)19. 이는 H 사이트20에서 D의 완전한 통합을 보장하는 완전히 유족 매체에서 자란 유기체에 의해 단백질이 발현되는 과정인 감쇠에 의해 달성될 수 있다20. 또한 교환 가능한 부위(titratable groups)에서만 H를 D로 교체하여 단백질을 부분적으로 중음화할 수 있으며, 교환가능한 탄소바운드 부위는 수소화21을 유지한다. 이것은 중음 어머니에게 수소화한 단백질 결정의 성장에 의해 달성될 수 있습니다22. 그러나 가장 일반적으로, 수소화 단백질의 H/D 교환은 H2O 기반 완충23에서 적당하게 큰 결정의 성장에 따라 증기 교환에 의해 수행된다. 이러한 경우, 결정은 석영 모세관에 장착되고 D20 기반의 어머니 술과 함께 증기로 평형화됩니다.
중성자 소스의 제한된 중성자 플럭스는 며칠에서 몇 주에 이르기까지 더 긴 데이터 수집 시간을 초래합니다24. ORNL에서는 IMAGINE과 MaNDi모두 2-6 Å 범위에서 좁은 파장 밴드패스를 사용하여 데이터 수집25를 최적화합니다. 데이터는 실온 또는 극저온에서 수집할 수 있습니다. Cryo 데이터 수집은 잠재적으로 데이터 품질을 개선하고 동결 트래핑 촉매 중간체의 가능성을 열어줍니다. 중성자 회절 데이터 수집에 이어, X선 데이터 세트는 전형적으로 동일한 온도또는 동일한 조건에서 재배된 결정에서 동일한 결정으로 수집됩니다26. 동일한 온도에서의 데이터 수집을 통해 X선 및 중성자 데이터 모두에 대해 구조 개선이 수행될 수 있으므로 물의 가시성 및 위치 변경 또는 대체 적합성을 가진 잔류물의 점유 와 같은 잠재적인 온도 유발 유물을 방지할 수 있습니다27. 조인트 X-ray 중성자 데이터 정제는 데이터 대 파라미터 비율을 증가시키고 단백질 백본 좌표를 X선 데이터에 대해 정제할 수 있도록 하는 이점을 제공하며, 중성자 회절 데이터는 H/D 원자28의 위치를 구체화하는 데 사용된다. 이것은 단백질에 교환할 수 없는 사이트에 H 원자로 인한 밀도 취소가 존재하는 부분적으로 유족 시료를 사용할 때 특히 유용합니다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 중성자 구조의 수를 훨씬 초과하지만, X선 데이터의 정제를 위해 처음 설계된 소프트웨어 패키지는 중성자 데이터를 포괄하도록 확장되었습니다3,29,30. 데이터 수집에 따라 페닉스.refine, CNSsolve(nCNS) 또는 SHELXL28,31,32,33과 같은 정제 패키지를 사용하여 모델을 구체화할 수 있습니다. 정제 과정에서 중성자 산란 밀도 맵은 COOT34를 사용하여 수동 피팅을 위해 시각화할 수 있습니다. 구조 솔루션에 따라 좌표 및 중성자 및/또는 X선 회절 데이터 파일을 PDB에 제출할 수 있으며, PDB는 모델을 검증하고 입금하여 공용 access18,29,30에 사용할 수 있습니다.
단백질의 구조적 분석은 수많은 기술이 그들의 기능 및 기계장치를 조사하는 데 사용되는 다각적인 접근 방식입니다35. 중성자 단백질 결정학은 X 선 회절, 분광법, 핵 자기 공명 (NMR) 또는 마이크로 결정 전자 회절 (microED)36과 같은 추가 연구에서 결과를 확장하고 보완하기 위해 귀중한 화학 적 통찰력을 제공합니다. H 원자가 화학의 중심이기 때문에 중성자 단백질 회절은 효소 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 독특하게 배치됩니다. 중성자에 의해 유도된 방사선 손상의 부재는 그(것)들에게 금속로단백질37의 연구 결과에 예외적으로 적합한 프로브를 만듭니다. 여기서는 시료 제제에서 데이터 수집, 정제 및 분석에 이르기까지 중성자 단백질 회절 과정의 대표적인 예를 제시한다(도 1). 중성자 회절 실험을 위한 충분한 크기의 결정은 금속 단백질 Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D)의 성장되었습니다. 노스캐롤라이나 LPMO9D는 글리코시딕 본드38,39에서 산소 원자 삽입에 의한 재발성 셀룰로오스의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질이다. NcLPMO9D 활성 부위에는 N단 히스티딘과 제2 보존 히스티딘(보충 도 3)40으로 구성된 특징적인 "히스티딘 브레이스"내에 단핵 구리 센터가 포함되어 있습니다. 곰팡이 LPMOs의 N 단말은 메틸화되지만 효모에서 재조합 식 중에 전환 후 수정이 발생하지 않습니다. NcLPMO9D 휴게 상태에서 구리 센터는 Cu2+ 산화 상태로 존재하며 단일 전자 감소에 의해 Cu1+로 활성화되어 분자 산소가 결합되어 슈퍼옥사이드 종41,42로 빠르게 감소하여 활성화될 수 있습니다. 전반적인 NcLPMO9D 반응은 하이드록실화 다당류 생성물43을 형성하기 위해 전자 1개와 양성자 2개를 추가해야 한다. 다당류 기판으로부터 수소 원자 추상화(HAA)를 담당하는 활성 산소 종의 정체가 확인되지 않았으며 집중적인 구조 및 계산 연구가 현재 진행 중이다44,45. NcLPMO9D 활성 부위의 레독스 화학을 감안할 때, 방사선 손상의 완화는 특히 관련이 있습니다. NcLPMO9D 결정에 대한 실온 및 극저온 데이터 수집을 여기서 설명하여 휴식 상태 및 활성화된 감소 형태로 NcLPMO9D 구조를 결정한다46. 단백질 결정 마운팅, 데이터 수집을 위한 빔라인 계측기 설치, 데이터 준비 및 좌표 파일 및 모든 원자 중성자 구조를 모델링하는 데 필요한 미세 조정 단계에 중점을 둡니다.

<table><tbody><tr><td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td><td>DiaDent/DiaVet</td><td>218-292</td><td></td></tr><tr><td>Capillary wax</td><td>Hampton</td><td>HR4-328</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>Version 7.0.077</td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td><td>Corning</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>Version 0.8.9.2</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap ALS</td><td>Hampton</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Curved-Tip Forceps</td><td>Mitegen</td><td>TW-CTF-1</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &amp;ge;99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>543047</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &amp;micro;m</td><td>Mitegen</td><td>M5-L18SP-1000</td><td></td></tr><tr><td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td><td>Mettler Toledo</td><td>30266626</td><td></td></tr><tr><td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td><td>Spearlab</td><td>M-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Four Color Mounting Clay</td><td>Hampton</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &amp;ge;99.5% (T),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td><td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td><td>XtaLAB Synergy-R</td><td>Home source X-ray diffractometer</td></tr><tr><td>Magnetic Wand Straight</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013198</td><td></td></tr><tr><td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &amp;ndash; 20 &amp;micro;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &amp;times; 96 pcs.)</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes volume 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td></td><td>Version 1.14-3260</td><td></td></tr><tr><td>Pin Tong 18 mm</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013196</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Volume 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683779</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Volume 100-1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683825</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Volume 10-100 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Volume 20-200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683817</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td><td>Hampton</td><td>HR6-146</td><td>Thin-walled capillary</td></tr><tr><td>Research Stereomicroscope System</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td><td>Mitegen</td><td>GB-B3-R</td><td></td></tr><tr><td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td><td>VitroCom</td><td>CV1012</td><td>Thick-walled capillary</td></tr><tr><td>Sandwich Box with cover</td><td>Hampton</td><td>HR3-132</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td><td>Hampton</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td><td>Mitegen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176788</td><td></td></tr><tr><td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td><td>Hampton</td><td>HR3-247</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-136</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>Wax pen</td><td>Hampton</td><td>HR4-342</td><td></td></tr></tbody></table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

중성자 결정예학은 생물학적 거대 분자 내에서 수소 원자 위치를 측정할 수 있는 구조 기술로, 방사선 손상을 유도하지 는 않지만 프로토네이션 및 수화 상태에 대한 기계적으로 중요한 정보를 산출합니다. 반면 X선 회절은 광 원자의 위치에 대한 제한된 정보만 제공하며 X선 빔은 감광성 보조인 및 금속 센터의 방사선 손상을 빠르게 유도합니다. 여기에 제시된 오크 리지 국립 연구소(ORNL)의 IMAGINE 및 MaNDi 빔라인에 사용되는 워크플로우가 적절한 크기의 단백질 결정이 커지면 중성자 회절 구조를 얻습니다(> 0.1 mm3). 중성자 회절 데이터 수집을 위해 석영 모세혈관에 수소화 단백질 결정의 장착을 시연합니다. 또한 중수소가 있는 교환 가능한 현장에서 수소 원자의 교체를 보장하기 위해 D2O 함유 버퍼를 장착한 결정의 증기 교환 공정도 제시된다. 중수소의 통합은 수소 원자의 일관되지 않은 산란으로 인한 배경을 줄이고 부정적인 일관된 산란 길이로 인한 밀도 취소를 방지합니다. 샘플 정렬 및 실온 데이터 수집 전략은 높은 플럭스 동위원소 반응기(HFIR)에서 IMAGINE에서 준 Laue 데이터 수집을 사용하여 설명됩니다. 또한, 황량한 반응 중간체를 트랩하기 위해 극저온 데이터 수집을 위한 액체 질소의 결정 장착 및 신속한 동결은 스발레이션 중성자 소스(SNS)의 MaNDi 비행 시간 계측기에서 입증된다. 모델 좌표 및 회절 데이터 파일 및 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵의 시각화준비도 해결됩니다. 중성자 데이터 전용 또는 관심 있는 단백질의 모든 원자 구조를 얻기 위한 관절 X선/중성자 데이터에 대한 구조 개선이 마침내 논의될 것이다. 중성자 구조를 결정하는 과정은 글리코시딕 본드의 산화 분열을 통해 반발성 다당류의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질인 리시성 다당류 단산소효소 단산소효소 의 결정으로 입증될 것이다.

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Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.8K 조회수.  North Carolina State University. 중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the propagation of neurodegenerative disorders. Such assemblies consist in multiple protein subunits organized in a non-covalent way to form large macromolecular objects that can execute a variety of cellular functions or cause detrimental consequences. Atomic insights into the assembly mechanisms and the functioning of those macromolecular assemblies remain often scarce since their inherent insolubility and non-crystallinity often drastically reduces the quality of the data obtained from most techniques used in structural biology, such as X-ray crystallography and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We here present magic-angle spinning solid-state NMR spectroscopy (SSNMR) as a powerful method to investigate structures of macromolecular assemblies at atomic resolution. SSNMR can reveal atomic details on the assembled complex without size and solubility limitations. The protocol presented here describes the essential steps from the production of 13C/15N isotope-labeled macromolecular protein assemblies to the acquisition of standard SSNMR spectra and their analysis and interpretation. As an example, we show the pipeline of a SSNMR structural analysis of a filamentous protein assembly.

Structures of supramolecular protein assemblies at atomic resolution are of high relevance because of their crucial roles in a variety of biological phenomena. Herein, we present a protocol to perform high-resolution structural studies on insoluble and non-crystalline macromolecular protein assemblies by magic-angle spinning solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (MAS SSNMR).

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

연구

생화학

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the investigation of biological materials, biofuel processing, and bio-inspired materials covering nanometer to micrometer length scales. The methods presented here for investigating physical properties (i.e., size and shape) of membrane proteins (here, MmIAP, an intramembrane aspartyl protease from Methanoculleus marisnigri) in solutions of micelle-forming detergents are well-suited for this small-angle neutron scattering instrument, among others. Other biophysical characterization techniques are hindered by their inability to address the detergent contributions in a protein-detergent complex structure. Additionally, access to the Bio-Deuteration Lab provides unique capabilities for preparing large-scale cultivations and expressing deuterium-labeled proteins for enhanced scattering signal from the protein. While this technique does not provide structural details at high-resolution, the structural knowledge gap for membrane proteins contains many addressable areas of research without requiring near-atomic resolution. For example, these areas include determination of oligomeric states, complex formation, conformational changes during perturbation, and folding/unfolding events. These investigations can be readily accomplished through applications of this method.

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

This protocol demonstrates how to obtain a low-resolution ab initio model and structural details of a detergent-solubilized membrane protein in solution using small-angle neutron scattering with contrast-matching of the detergent.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are available and display reproducibly high-resolution X-ray diffraction properties, crystallography is among the most preferred methods for fragment screening because of its sensitivity. Additionally, it is the only method providing detailed 3D information of the binding mode of the fragment, which is vital for subsequent rational compound evolution. The routine use of the method depends on the availability of suitable fragment libraries, dedicated means to handle large numbers of samples, state-of-the-art synchrotron beamlines for fast diffraction measurements and largely automated solutions for the analysis of the results.
Here, the complete practical workflow and the included tools on how to conduct crystallographic fragment screening (CFS) at the Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) are presented. Preceding this workflow, crystal soaking conditions as well as data collection strategies are optimized for reproducible crystallographic experiments. Then, typically in a one to two-day procedure, a 96-membered CFS-focused library provided as dried ready-to-use plates is employed to soak 192 crystals, which are then flash-cooled individually. The final diffraction experiments can be performed within one day at the robot-mounting supported beamlines BL14.1 and BL14.2 at the BESSY&#160; II electron storage ring operated by the HZB in Berlin-Adlershof (Germany). Processing of the crystallographic data, refinement of the protein structures, and hit identification is fast and largely automated using specialized software pipelines on dedicated servers, requiring little user input.
Using the CFS workflow at the HZB enables routine screening experiments. It increases the chances for successful identification of fragment hits as starting points to develop more potent binders, useful for pharmacological or biochemical applications.

Crystallographic fragment screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin is performed using a workflow with dedicated compound libraries, crystal handling tools, fast data collection facilities&#160;and largely automated data analysis. The presented protocol intends to maximize the output of such experiments to provide promising starting points for downstream structure-based ligand design.

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, chlorine, or calcium, that are often natively present in macromolecules. This enables the direct structure solution of proteins and nucleic acids via experimental phasing without the need of additional labelling. To eliminate the significant air absorption of X-rays in this wavelength regime, these experiments are performed in a vacuum environment. Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, is the first synchrotron instrument of its kind, designed and optimized for MX experiments in the long wavelength range towards 5 &#197;. 
To make this possible, a large vacuum vessel encloses all endstation components of the sample environment. The necessity to maintain samples at cryogenic temperatures during storage and data collection in vacuum requires the use of thermally conductive sample holders. This facilitates efficient heat removal to ensure sample cooling to approximately 50 K. The current protocol describes the procedures used for sample preparation and transfer of samples into vacuum on beamline I23. Ensuring uniformity in practices and methods already established within the macromolecular crystallography community, sample cooling to liquid nitrogen temperature can be performed in any laboratory setting equipped with standard MX tools. 
Cryogenic storage and transport of samples only require standard commercially available equipment. Specialized equipment is required for the transfer of cryogenically cooled crystals from liquid nitrogen into the vacuum endstation. Bespoke sample handling tools and a dedicated Cryogenic Transfer System (CTS) have been developed in house. Diffraction data collected on samples prepared using this protocol show excellent merging statistics, indicating that the quality of samples is unaltered during the procedure. This opens unique opportunities for in-vacuum MX in a wavelength range beyond standard synchrotron beamlines.

Here, we present a protocol for cryogenic sample preparation and transfer of crystals into the vacuum endstation on beamline I23 at Diamond Light Source, for long-wavelength macromolecular X-ray crystallography experiments.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX beamlines having been built and increased availability of structure refinement software. However, the neutron sources currently available for NMX are significantly weaker than equivalent sources for X-ray crystallography. Despite advances in this field, significantly larger crystals will always be required for neutron diffraction studies, particularly with the tendency to study ever-larger macromolecules and complexes. Further improvements in methods and instrumentation suited to growing larger crystals are therefore necessary for the use of NMX to expand.
In this work, we introduce rational strategies and a crystal growth bench (OptiCrys) developed in our laboratory that combines real-time observation through a microscope-mounted video camera with precise automated control of crystallization solutions (e.g., precipitant concentration, pH, additive, temperature). We then demonstrate how this control of temperature and chemical composition facilitates the search for optimal crystallization conditions using model soluble proteins. Thorough knowledge of the crystallization phase diagram is crucial for selecting the starting position and the kinetic path for any crystallization experiment. We show how a rational approach can control the size and number of crystals generated based on knowledge of multidimensional phase diagrams.

Structural studies of biomacromolecules by crystallography require high-quality crystals. Here we demonstrate a protocol that can be used by OptiCrys (a fully automated instrument developed in our lab) and/or microdialysis buttons for growing large high-quality crystals based on knowledge of the crystallization phase diagram.

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

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