마이크로 환경은 사이토카인, 리간드 농도 및 조성물을 변화시키는 것을 포함하여 매우 복잡하고 역동적인 것을 가능하게 합니다. 유사한 배양 환경을 조성하는 것은 줄기 세포 분화, 면역 반응 및 칩 플랫폼에서 장기의 개발과 같은 복잡한 생명 기계에 대한 체외 연구에 매우 중요합니다. 그러나 나노리터 부피 및 밀리초 정확도의 화학 신호를 생성하고 전달하는 것은 파이펫팅과 같은 기존의 생물 의학 접근법을 사용하기가 어렵습니다.
이러한 과제를 해결하기 위해 동적 결합 및 순차적 신호 입력의 대체 이미지 수집 생성을 할 수 있는 문화 플랫폼이 수요가 많습니다. 이 프로토콜에서는 미세 유체 장치의 설계 및 제조 절차가 제시됩니다. 제안된 미세 유체 칩은 1500배양양장치, 향상된 연동 펌프 배열 및 현장 혼합 계수로 구성되어 있습니다.
우리는 플랫폼이 단일 세포 2 차원 세포 인구와 3 차원 신경 구에 대한 연구에 적합하다는 것을 보여줍니다. 칩에 복잡하고 역동적인 환경 조건은 신경 줄기 세포 분화 및 자기 재생에 큰 영향을 미칩니다. 디자인 및 제작 절차의 세부 사항은 다음과 같습니다.
AutoCAD 소프트웨어를 사용하여 칩 설계가 수행되었습니다. 현미경에 플레이트 홀더의 크기에 맞게, 미세 유체 칩은 크기가 약 7 x 5 센티미터이며 1, 500 배양 챔버로 구성되어 있습니다. 중요한 특징 중 하나는 8개의 유량 채널과 200마이크로미터 폭 제어 채널로 구성된 연동 펌프를 갖추고 있다는 것입니다.
제어와 유량 채널 사이의 중복 면적의 증가는 2002년 스티븐 퀘이크가 제안한 연동 펌프에 비해 16배 증가하여 펌핑 사이클당 약 15나노리터 액체및 펌핑 사이클당 1, 500개의 독립적인 환경 조건을 칩에 병렬로 유지해야 할 필요성에 충분합니다. 장치의 또 다른 중요한 부분은 전단없는 문화 환경을 유지할 수있는 2 층 배양 챔버입니다. 원치 않는 전단 응력은 상단 레이어를 통해 빠르게 지시하여 방지됩니다.
세포, 조직 및 중요한 조건부 배지는 아래층에서 그대로 유지됩니다. 수치 시뮬레이션은 액체가 배양 챔버를 통해 지시될 때 왼쪽에서 오른쪽으로 있음을 시사합니다. 전단 력을 효과적으로 방지할 수 있습니다.
초당 10 밀리미터의 입력 유량 또는 마이크로미터 크기의 조직에서도 배양 장치의 바닥에 방해받지 않고 남아 있습니다. 우리는 UV 리소그래피를 사용하여 복제 성형 또는 실리콘 웨이퍼를 제작했습니다. 높이 25마이크로미터의 유체 채널과 무게 100 마이크로미터의 유체 채널은 SU-8 3025 네거티브 포토레지스트를 사용하여 생산됩니다.
75 마이크로미터와 150 마이크로미터높이의 배양챔버는 SU-8 3075 포토레지스트를 사용하여 제작되었다. AZ50X 포지티브 포토레지스트는 좋은 연결을 보장하기 위해 제어 채널과 겹치는 둥근 모양의 웰 피처에 사용됩니다. 마이크로플루딕 칩을 생성하기 위해 패턴 및 빈 실리콘 웨이퍼를 TMCS로 먼저 처리했습니다.
PDMS 10 대 1의 상이한 수량의 단량은 0.85 메가파스칼에서 진공 챔버에서 1~2시간 동안 철저하게 혼합및 분해하였다. 제어 층은 2, 200 RPM에서 스핀 코팅 PDMS에 의해 얻어졌다. 실리콘 웨이퍼는 인큐베이터로 옮겨져 80센티미터에서 60분 동안 배양했습니다.
서로 다른 층은 맞춤형 광학 장치와 플라즈마 에칭 기계를 사용하여 함께 정렬및 결합되었습니다. 입구 구멍은 80 센티미터에서 또 다른 두 시간 열 접합 후 펀치했다. 칩은 PDMS 코팅 커버 슬립에 결합되었다, 이는 96 웰 플레이트의 동일한 크기이며 사용하기 전에 80 중심에서 적어도 12 시간 동안 경화.
작동을 위해 제어 채널은 플라스틱 튜브를 통해 소형 공압 솔레노이드 밸브에 연결되었습니다. 모든 페추매틱 웰을 선회하는 것은 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 사용자 지정 MATLAB 프로그램에 의해 제어되었습니다. 푸시업 PDMS 멤브레인 밸브의 최적의 종결 압력은 각 칩에 대해 개별적으로 결정되었으며, 이는 일반적으로 25PSI에서 30PSI사이입니다.
일련의 웰을 동적으로 결합하고 순차적인 입력을 모두 돌리면 칩에서 생성될 수 있다. 세포는 80%의 수렴으로 수확되었고, 밀리리터당 전력 6에 대한 밀도에서 배양 배지 DMEM으로 재장축되었고, 이어서 이를 함유하는 세포를 가압하여 칩에 적재하였다. 신경 줄기 세포의 부착 및 현탁액 배양 모두에 대해, 세포를 수집하고 구체는 칩에 직접 로드되었다.
이미지 수집을 위해 자동 번역 단계와 디지털 보완 금속 -산화물 반도체 카메라가있는 반전 된 현미경이 사용되었습니다. 단계 및 이미지 수집은 4배 의 객관적 렌즈로 예비 이미징을 얻기 위해 왼쪽 상단 모서리와 오른쪽 아래 모서리 챔버를 선택점으로 제어하고 번역 단계를 순서대로 포인트로 이동하여 제어되었다. 20x로 4x 목표 렌즈를 변경하고 광 강도, 노출 시간, 등 세테라를 포함한 이미징 파라미터를 조정합니다.
그런 다음 각 챔버의 위치가 13x15 챔버 매트릭스로 남기거나 프로그램에 의해 자동으로 정의되도록 선택 점을 찾습니다. 챔버의 좌표를 결정하면 번역 단계는 X, Y, Z 초점 평면을 미세 조정할 수있는 각 챔버로 이동합니다. 이미징 주기의 간격과 지속 시간을 설정합니다.
경로를 저장한 다음 이미징을 시작합니다. 이 시스템은 신경 줄기 세포 구형의 과정의 밝은 필드에서 신경 줄기 세포 분화 및 형광 필드와 같은 다양한 표적 동적 추적에 사용할 수 있습니다. 데이터 분석.
사용자 지정 MATLAB 프로그램을 사용하여 nd2에서 Tif로 형식을 변경합니다. 그리고 점에 따라 데이터를 나눕니다. 분석할 대상을 선택하는 것은 세포 또는 조직이다.
임계값, 개체 크기, 노이즈 크기를 해석합니다. 또는 단계별 분석을 최적의 매개 변수로 선택할 수 있습니다. 그런 다음 모든 데이터를 분석합니다.
결과를 MAT 형식으로 저장한 후 플롯을 사용하여 결과 또는 추적을 그립니다. 본 논문에서, 우리는 살아있는 세포 미세 환경 동적 제어를 위한 광석 촬영 기술을 기반으로 하는 고처리량 미세 유체 칩 시스템의 프로토콜 및 배양에 대해 설명했습니다. 우리는 또한 PDMS 멤브레인 밸브의 폐쇄 압력과 챔버의 병렬로 유체의 스핀 제어와 같은 신중하게 제어해야하는 몇 가지 매개 변수를 설명했습니다.
전통적인 세포 내 체외 배양에서 세포 배양 환경의 치료는 수동으로 수행되며, 이는 시간이 많이 걸리고 힘들고 유체가 채워져 표준 제어가 쉽지 않다. 특히 몇 분 간의 솔루션. 입력 생성, 면역 약물 농도 및 큰 소비와 같은 몇 가지 문제가 있습니다.
그러나, 당사의 미세유체 시스템을 이용하여, 고정 용량의 단일 유체 동등한 양의 균일한 농도로 자극기로 반복할 수 있으며, 서로 다른 배양챔버에서 상이한 배양을 동시에 비교할 수 있다. 일부 미니어처 측두해상도 백 자극과 유체 조절을 통해 해상도를 하위설정하는 다른. 또한, 우리의 시스템은 간단한 작업에 의해 비교 실험 결과의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다.
우리의 시스템은 확산의 원리에 기초하고, 세포 미세 환경에 최소한의 기계적 장애를 만듭니다. 보다 안정적인 세포 마이크로환경 칩을 위해 배양층의 깊이로서 완충층의 목록을 늘리거나 중간 교환의 입력 유체를 감소시킬 수 있으며, 이는 세포 거동에 대한 연구를 위해 여기에 있을 압력을 감소시킬 것이다. 이 연구는 3T3 및 NSC 세포의 배양만 을 검토했다는 것을 주목해야 합니다.
다른 세포 또는 세포주에 대 한, 배양 조건 그것을 조정 하는 우리의 매개 변수와 비교.
