Name: controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
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여기에 포함 된 일부 수치는 저작권 허가 센터의 허가에 의해 적응되었습니다 : 스프링어 자연, 생물 의학 공학의 연보. 라이브 현미경 이미징을 가능하게하면서 균일 한 z 축 균주를 가진 3D 하이드로겔을 긴장, A. Roitblat 리바, S. 나탄, A. 콜렐, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, 저작권© (2019).
https://doi-org.bdigitaluss.remotexs.co/10.1007/s10439-019-02426-7

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본 원에 제시된 방법 및 프로토콜은 주로 Roitblat Riba 외.41에 의한 이전 연구를 기반으로 하며, 여기에 SCyUS 장치의 전체 컴퓨터 지원 설계(CAD), 파이썬 및 마이크로 컨트롤러 코드를 포함합니다.
기존 접근법에 비해 제시된 방법의 주요 장점은 매우 부드러운 3D 하이드로겔(+100 Pa의 탄성 계수)을 둘레에서, 그리고 살아있는 공초점 이미징하에서 변형할 가능성을 포함한다. 다른 방법은 일반적으로 Z축에서 변형 필드를 적용하는 능력이 제한되며 주로 샘플에서 객관적렌즈에 이르는 작업 거리 제한으로 인해 스트레칭하는 동안 현장에서 높은 배율 현미경 이미지를 제공할 수 없습니다. 대부분의 사용 가능한 시스템은 생리 조직 환경을 모방하는 데 제한된 2D 기판 스트레칭을 기반으로합니다.
시스템의 한계는 젤 포스트 폴리머화(도7A)의섬유 밀도의 잠재적 일관성없는 균질성을 포함하며, 특히 큰 겔 부피 또는 복잡한 형상이 사용되는 경우. 이러한 비균질성은 젤에서 비균일한 균주 및 섬유 정렬로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 상대적으로 깊은 Z-단면(>30 μm)에서광학 제한은 섬유 배향의 분석에 있는 오류를 초래할 수 있습니다.
3D 스트레치 프로토콜의 중요한 단계는 다음 (i) 샘플 젤이 특히 Z-방향을따라 거품이나 눈물없이 실리콘 내에서 기하학적 컷아웃의 내부 벽에 완전한 접착력을 달성되었는지 확인하는 것을 포함한다. 최소 100μm(Eq. 1)의두께를 가진 시료의 완전한 접착력 및 연속성은 시료를 원하는 스트레인(ii)으로 안정적으로 스트레칭하는 것이 중요하며, 이는 스트레칭 전에 SCyUS 장치에 시료를 적절히 부착하는 것이 중요하다. 3D 프린팅 지그(그림5A)를이용하여 실리콘 스트립과 신축성 없는 패브릭 길이 익스텐더에 부착하고 모든 조각이 인라인으로 부착되어 있는지 검증하여 겔에서 균주가 겔에서 대칭적으로 유도되도록 해야 한다. 이는 또한 장치의 스핀들(도6B-C)(iii)의정확한 로딩에 적용되며, 시료의 참조(사전 스트레치) 위치를 신중하게 캡처한다. 샘플이 이미 장력 상태인 동안 참조 이미지를 촬영하는 경우(예: 이 단계 이전에 서보모터의 부착으로 인해) 모든 스트레인 측정이 부정확합니다.
향후 향후 응용 프로그램 및 제시된 프로토콜의 수정에는 다음이 포함됩니다.
(i) 순환 스트레치 정권은 세포 임베디드 하이드로겔에 적용될 수 있다. 모터의 동적 움직임이 마이크로 컨트롤러 소프트웨어에 의해 인코딩됨에 따라 모든 순환 프로파일은 시스템에 사용되는 모터의 해상도 및 회전 속도에 의해서만 제한될 수 있습니다(Roitblat Riba외. 41에서사용할 수 있는 자세한 세부 정보). 이 작품에서, 우리는 피브린 젤이 동적 스트레치(표 1)에서접착력을 유지할 수 있음을 입증했다. 추가 테스트가 필요하지만 순환 하중을 적용하면 하이드로겔 및 임베디드 셀의 동적 반응에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
(ii) 실리콘 컷아웃의 형상및 부피를 수정할 수 있다. 현재 프로토콜에서는 원형 형상의 젤에만 초점을 맞췄습니다. 이러한 조건에서, 내부 균주는 우리의 FE 시뮬레이션에 의해 예측된 대로 젤 전체에 걸쳐 상대적으로 균일합니다(그림 13). 그러나 실리콘의 컷아웃 섹션을 수정하여 다른 겔 형상을 고려하면 그라데이션이 나타납니다. 예를 들어, '다이아몬드' 모양의 컷아웃은 스트레치 방향을 따라 컷아웃의 초기 길이가 점진적으로 변화하여 젤 균주에 있는 그라데이션으로 이어질 수 있습니다. 젤 변형 제어의이 방법은 특히 매력적이다, 다른 모양의 컷 아웃은 제조상대적으로 사소한으로. 또한 실리콘 컷아웃의 두께와 면적을 쉽게 변경하여 몇 마이크로리터의 소형 볼륨에서 mm-cm 스케일 젤 크기와 관련된 더 큰 볼륨에 이르기까지 젤 볼륨을 쉽게 조정할 수 있습니다. 또한 동일한 실리콘 스트립에 여러 컷아웃을 포함하여 여러 젤을 동시에 스트레칭할 수 있습니다.
(iii) 셀은 하이드로겔에 내장될 수 있다. 뻗은 하이드로겔에 세포를 포함할 때 고려해야 할 몇 가지 과제가 있습니다. 3D 하이드로겔에 내장된 대부분의 셀은 행렬에 상당한 견인력을 적용하고 시간이 지남에 따라 행렬을 저하시다. 이로 인해 젤의 글로벌 수축과 소화가 발생할 수 있으며, 이는 인큐베이션의 장기간에 실리콘 컷아웃 내부 벽에서 젤의 연결이 끊어질 수 있습니다. 이러한 상황에 대처하는 가능한 방법은 낮은 세포 농도를 사용하고 세포 실험의 시간을 겔 수축 및 저하가 최소화하는 간격으로 제한하는 것이다. 우리는 이전에 실리콘 컷 아웃(41)에서겔 찢어지거나 단절의 증거없이, 5 시간의 기간 동안, 10 %의 정적 스트레칭에서 피브린 젤에서 섬유 아세포 세포를 배양의 가능성을 입증했다.
(iv) 이 설정은 또한 다른 유형의 하이드로겔, 특히 폴리아크릴아미드(PAA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 하이드로겔과 같은 합성 제품으로 테스트되어야 하며, 이는 세포 배양에 일반적으로 사용된다. 실리콘 컷아웃에 이러한 하이드로겔의 자연적인 접착을 검사해야 하며, 겔 스트레칭에 부족한 것으로 판명되면 접착력을 장려하는 기술을 사용해야 합니다. 생물학적접착제(48),49 또는 화학적 치료50,51, 52를 컷아웃 표면에 사용하는 것을 고려해야 한다.

기계적 힘에 대한 조직 반응은 유전자 발현1,세포 분화2및 조직 리모델링3을포함하는 광범위한 생물학적 기능의 필수적인 부분이다. 더욱이, 섬유 정렬 및 밀도와 같은 세포외 매트릭스(ECM)의 강제 유도 된 변화는 세포 거동 및 조직형성에영향을 미칠 수 있습니다4,5,6. ECM의 섬유질 메쉬 구조는 비선형 탄성, 비미세 변형 및 플라스틱 변형7,8,9,10,11,12와같은 흥미로운 기계적 특성을 갖는다. 이러한 특성은 세포와 주변 미세 환경이 외부 기계적힘(13,14)에어떻게반응하는지에영향을 미칩니다. ECM과 조직이 기계적 힘에 어떻게 반응하는지 이해하면 조직 공학 분야와 보다 정확한 전산 및 이론적 모델 의 개발에서 진전을 이룰 수 있습니다.
기계적으로 샘플을 스트레칭하는 가장 일반적인 방법은 세포 거동에 미치는 영향을 탐구하기 위해 세포가 풍부한 2D 기판에 초점을 맞추고있다. 이들은 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 균주를 적용하고 스트레치방향(15,16,17,18,19)과관련하여 세포 배향 각도를 분석한다. 그러나, 외부 스트레치에 3D 세포 임베디드 하이드로겔의 반응을 조사하는 방법은 조직 미세 환경을 보다 밀접하게 모방하는 상황이더 제한적이다. 3D 스트레칭 방법을 향한 어드밴스는 세포가 3D행렬(20)과비교할 때 2D 기판에서 다르게 행동하기 때문에 특히 중요합니다. 이러한 거동은 세포 재조정, 단백질 발현 수준 및 이동패턴(21,22,23)을포함한다.
3D 샘플 스트레칭을허용하는 방법 및 장치는24, 25, 26,27,28 및 실험실 연구를 위해 개발된29개모두를 포함한다. 이들 방법은 분해성 실리콘튜브(30),다중웰 챔버31개,클램프26,32,생물반응기11,33,캔틸레버34,35,36,및 자석37,38을사용한다. 일부 기술은 젤5의두 단일 지점에서 바늘을 당겨서 3D 하이드로겔을 국소 변형시키는 스트레치를 생성하고, 다른 기술은겔(16)의전체 대량의 변형을 허용한다. 더욱이, 이러한 시스템의 대부분은 Z-방향의스트레인 필드에 대한 제한된 정보와 함께 X-Y 평면에서 스트레인 필드의 분석에 초점을 맞춥니다. 추가적으로, 이 장치의 소수만이 시투 화상 진찰에 있는 현미경을 할 수 있습니다. 시상 고배율 이미징(예: 공초점 현미경)의 주요 과제는 객관적인 렌즈에서 샘플까지 수백 미크론의 제한된 작업 거리입니다. 스트레치 중에 라이브 이미징을 허용하는 장치는 Z축에서 균주의 균일성을 희생하거나 상대적으로 복잡하고 다른 실험실에서 재현하기 어려운39,40.
스트레치 3D 하이드로겔에 대한 이 접근법은 살아있는 공초점 현미경 검사관 동안 정적 또는 주기적 원색 균주를 허용합니다. 스트레칭 장치('스마트 순환 동종 들것 - SCyUS'라고 함)는 3D 인쇄 부품과 저비용 하드웨어를 사용하여 제작되어 다른 실험실에서 쉽게 재현할 수 있습니다. 장치에 부착된 것은 중앙에 기하학적 컷아웃이 있는 시판되는 실리콘 고무입니다. 하이드로겔 성분은 컷아웃을 채우기 위해 중합된다. 중합 화 하는 동안, 생물 하이드로 겔, 피브린 또는 콜라겐 등, 자연스럽 게 컷 아웃의 내부 벽에 부착. SCyUS를 사용하여 실리콘 스트립은 단원하게 뻗어 임베디드 3D하이드로겔(41)으로제어된 균주를 이송한다.
이 시스템은 다른 기존 방법에 비해 기능과 장점의 독특한 조합을 할 수 있습니다. 첫째, 이 시스템은 하이드로겔 전체에 걸쳐 Z-균질변형과 함께 주변에서 두꺼운 3D 소프트 하이드로겔(>100 μm 두께, <1 kPa 강성)의 단방향 스트레칭을 허용합니다. 이러한 하이드로겔은 기존의 인장 기술에 의해 잡히고 뻗어 너무 부드럽습니다. 둘째, 3D 프린팅은 연구원이 쉽게 사용할 수 있고 설계에 사용되는 전자 장치가 저렴한 비용으로 사용되기 때문에 스트레치 장치는 다른 실험실에서 쉽게 복제 될 수 있습니다. 셋째, 아마도 가장 매력적인 기능, 실리콘 스트립에서 컷아웃의 형상 및 크기는 쉽게 조작할 수 있어, 튜닝 가능한 스트레인 그라데이션 및 경계 조건뿐만 아니라 다양한 샘플 볼륨을 몇 마이크로리터까지 사용할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 라이브 공초점 현미경 검사의 밑에 uniaxial 스트레치에 의해 진행된 0.5 mm 두께의 실리콘 고무 스트립에 있는 ~2mm 직경 디스크로 성형 피브린 젤로 이루어져 있습니다. 다음은 기하학적 컷아웃에 작용하는 균주를 측정하고 분석하기 위한 실험 절차, 하이드로겔에서 개발된 내부 균주, 다양한 스트레치 조작 후의 결과 섬유 정렬에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 하이드로겔에 세포를 포함하고 통제된 외부 스트레치에 노출시킬 가능성에 대해 논의된다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester</td><td>Invitrogen</td><td>A20002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td><td>Biological Industries</td><td>01-052-1A</td><td>Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Cover Slip #1.5</td><td>Bar-Naor Ltd.</td><td>BN72204-30</td><td>22&amp;times;40 &lt;em&gt;mm&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D-5879-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>EVICEL Fibrin Sealant (Human)</td><td>Omrix Biopharmaceuticals</td><td>3902</td><td>Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/&lt;em&gt;mL&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Fibrinogen Buffer</td><td>N/A</td><td></td><td>Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride &amp;amp; 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)</td></tr><tr><td>Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 &lt;em&gt;&amp;micro;m&lt;/em&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>F8820</td><td>Orange (540/560)&lt;br/&gt; Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide</td></tr><tr><td>High-Temperature Silicone Rubber</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T41</td><td>580 &lt;em&gt;&amp;micro;m&lt;/em&gt;-thick&lt;br/&gt; E = 1.5 Mpa&lt;br/&gt; Poisson Ratio = 0.48&lt;br/&gt; Tensile Strength = 4.8 MPa&lt;br/&gt; Upper limit of stretch = +300% engineering strain</td></tr><tr><td>HiTrap desalting column 5 &lt;em&gt;mL&lt;/em&gt; (Sephadex G-25 packed)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1408-01</td><td></td></tr><tr><td>HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound</td><td>Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.</td><td>HIVAC-G 100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI software&lt;sup&gt;39&lt;/sup&gt;</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD</td><td>Version 1.8.0_112</td><td></td></tr><tr><td>Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td><td>Arduino/Adafruit</td><td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td><td></td></tr><tr><td>MicroVL 21R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Primovert Light Microscope</td><td>Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td><td>491206-0011-000</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS CAD (Solidworks)</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS Code&lt;sup&gt;37&lt;/sup&gt;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Servomotor - TowerPro SG-5010</td><td>Adafruit</td><td>155</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td>For 50 &lt;em&gt;mL&lt;/em&gt; tubes</td></tr><tr><td>Sterile 10 &lt;em&gt;cm&lt;/em&gt; non-culture plates</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin buffer</td><td>N/A</td><td></td><td>Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>USB Cable (Type B Male to Type A Male)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>2811000417</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Release Version 14.0.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging

외부 힘은 조직 형성, 발달 및 유지 보수에 중요한 요소입니다. 이러한 힘의 효과 종종 시험 관 스트레칭 방법을 전문 사용 하 여 공부. 다양한 사용 가능한 시스템은 2D 기판 기반 들것을 사용하는 반면, 3D 기술의 접근성은 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 데 더 제한적입니다. 여기서는 탄성 실리콘 스트립을 샘플 캐리어로 사용하여 둘레에서 부드러운 하이드로겔의 외부 스트레칭을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 활용되는 스트레칭 시스템은 3D 인쇄 부품과 저비용 전자 장치로 구성되므로 다른 실험실에서 간단하고 쉽게 복제할 수 있습니다. 실험 공정은 실리콘 스트립의 중앙에 컷아웃에서 두꺼운(>100 μm) 소프트 피브린 하이드로겔(탄성 계수 ~100Pa)을 중합하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 실리콘 겔 구조는 인쇄 된 스트레칭 장치에 부착되고 공초점 현미경 단계에 배치됩니다. 살아있는 현미경 검사에서 스트레칭 장치가 활성화되고 겔은 다양한 스트레치 크기로 이미지됩니다. 영상 처리는 젤의 3D 두께(Z-축)에 걸쳐 상대적으로 균일한 균질균및 섬유 정렬을입증하여 생성된 겔 변형을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 방법의 장점은 시투 현미경 검사법에서 실행하는 동안 3D에서 매우 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 능력과 사용자의 요구에 따라 샘플의 형상 및 크기를 조작 할 수있는 자유를 포함한다. 또한, 적절한 적응을 통해, 이 방법은 다른 유형의 하이드로겔(예를 들어, 콜라겐, 폴리아크릴라미드 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 스트레칭하는 데 사용될 수 있으며, 더 많은 생체 모방 3D 조건 하에서 외부 력에 대한 세포 및 조직 반응의 분석을 허용할 수 있다.

1 μm 형광 구슬이 내장된 3D 피브린 하이드로겔을 운반하는 실리콘 스트립에 가해지는 증가 크기의 정적 스트레치로부터의 대표적인 데이터가 도 9에도시된다. 이 분석은 실리콘 스트레치가 절단의 기하학적 변화뿐만 아니라 젤 내의 개발 된 균주에 미치는 영향을 보여줍니다. 전체 젤의 Z-스택이미지는 타원형형상(도 9A)에컷아웃된 원래 원의 변형을 평가하는 데 사용된다. 이러한 이미지는 ε xx(구멍)(방정식 2)를계산하는 데 사용됩니다. 겔 스트레칭 동안 여러 비드 골재(도9B)를확대 및 수동으로 추적하여, 축 ε xx(gel)및 수직 εyy(gel)방향(도9C,D)에서중앙에서 국소 젤 균주의 계산을 허용한다. 축 균주는 실리콘 컷아웃 가장자리에서 젤의 중심으로 비교적 선형적으로 전파되며 압축 수직 균주(도9D)보다큽니다.
형광 표지 젤의 높은 배율 이미지는 실리콘 스트레치에 의해 유도된 섬유 정렬의 관찰 및 정량화를 허용합니다. 도 11은 스트레치 방향으로 고도로 정렬된 섬유를 묘사하는 고강도 컷아웃 균주(도11B)에서일반적인 비스트레칭 및 비교적 이소트로픽 하이드로겔(도11A)및 하이드로겔의 대표적인 줌인 이미지를 나타낸다. ImageJ를 이용한 섬유 리오리엔테이션 분석은 40%(도11D)를초과하는 균주에서 적당한 포화도를 가지면서 40%의 균주까지 40%의 균주에 대한 섬유 정렬(NOP)과 외부변형(ε구멍)사이의 대략 선형 의존도를 나타냈다. 다른 Z-슬라이스의 섬유 정렬에 대한 자세한 분석은 도 12에도시된다. 여기서, 섬유 정렬의 히스토그램은 각 Z-슬라이스(도12A)뿐만아니라 해당 NOP(도12B)에대해계산되며, 컷아웃의 각 외부 스트레인 크기에 대해 모든 Z-슬라이스에대한 평균 NOP(도12C). ε구멍이 증가함에 따라 도 12C에도시된 전체 비선형 곡선에 따라 섬유 정렬이 증가합니다. 겔은 도 12B에서더 높은 균주에서 더 짧은 선으로 표시되는 푸아송 효과로 인해 Z축을 따라 수축된다.
전체 젤에서 내부 균주의 심층 분석을 수행하기 어려운 것으로 입증되었기 때문에, 피브린(그림13)의기계적 특성을 감안할 때 2D 연속 재료에서 수행되는 유한 요소(FE) 시뮬레이션의 예비 결과를 제공합니다. 컷아웃의 외부 변형은 ~40%이며 컬러 맵은 스트레치 유도 스트레인 필드를 나타낸다. 색상 맵의 범위는 38%-42%로, 겔 균주가 원형 젤 영역 전체에서 비교적 균일하다는 것을 나타냅니다. 다른 젤 형상을 사용하는 경우 변형의 그라데이션이 발생할 수 있으며 이는 향후 연구를 위한 주제입니다.
임베디드 피브린 젤이 높은 균주(0 ~+30%)와 주파수(최대 1Hz)에서 실리콘 스트립에 대한 접착력을 유지할 수 있음을 입증하기 위해, 우리는 컷아웃의 내부 벽에서 젤의 분리를 보여주는 예비 테스트(이 시험에 대한 프로토콜은 이 작업에 포함되지 않음)를 실행했습니다. 3개의 젤을 시험하였다, 겔 1은 ~87분의 총 지속시간 동안, 겔 2는 60분 동안, 젤 3은 30분(표1). 이 세 가지 경우 모두 피브린 하이드로겔은 실리콘에 대한 접착력을 유지했습니다.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61671/61671fig11.jpg"> 그림 11: 외부 스트레치에 반응하여 젤 섬유 정렬. 형광 표지 젤의 중심에서 촬영한 이미지는(A)뻗지 않고(B)ε 홀의적용 후 = 80 %(C)ε 구멍 [%] 균주 하에서 섬유 방향의 평균 히스토그램을 평균화하였다. 회색 오차바는 각 테스트된스트레인(D)평균 네매틱 오더 파라미터(NOP)에 대해 평가된 z-stack에서 40개의 슬라이스 사이의 차이를 3가지 다른 젤 샘플(도 11A-C에서분석하는 "Gel 1"포함)에 대한 ε구멍의 함수로서 나타낸다. 오류 막대는 각 스트레치 크기의 Z-스택의슬라이스 간의 차이를 나타냅니다. 이 그림은 Roitblat Riba 등의 허가하에 적용되었습니다.41<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61671/61671fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61671/61671fig12.jpg"> 그림 12: 오리엔테이션J44 툴(ImageJ 소프트웨어)43(A) 3D 히스토그램을 사용하여 섬유 배향을 분석하여 다른 Z-슬라이스에대한 섬유 방향의 분석. 뻗어 있는(ε구멍 = 17.6 %, 상단) 및 언 스트레칭 (아래) 젤에 대해 계산 된 두 히스토그램의 예가 도시되어 있습니다. 히스토그램은 곡선 아래 영역이1(B)결과 NOP 대 Z-깊이와같도록 정규화된다; 그래프는 Z-깊이(C)의 함수로서 각 히스토그램의 NOP 계산을 ε구멍의함수로서 NOP를 나타낸다. 오류 막대는 동일한 젤의 동일한 XY 지점에서 개별 스트레치 크기의 모든 Z-슬라이스에 대한 NOP의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61671/61671fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61671/61671fig13v2.jpg"> 도 13: 스트레치 겔의 2D 유한 요소(FE) 시뮬레이션. 젤은 실리콘 캐리어에 의해 뻗어(ε 구멍 ≈ 40%). 스트레인 필드는 사소한 그라데이션이 관찰되는 최대 주 변형값으로 표시됩니다. 점선으로 표현되는 원은 구멍의 미리 변형된 형상이며, 원래길이(lo)는스트레치가 적용되기 전에 X축을 따라 중심 길이이며, 스트레치가 적용된 후 x축을 따라 중심길이(l)가된다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61671/61671fig13v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="10">젤 #1</td>
			<td>동적 스트레인 진폭(주파수 1Hz)</td>
			<td>동적 스트레치 지속 시간(분)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">0-37%</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">0-48%</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>동적 스트레치에서 총 시간</td>
			<td>87분</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">젤 #2</td>
			<td>동적 스트레인 진폭(주파수 1Hz)</td>
			<td>동적 스트레치 지속 시간(분)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">0-30%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>0-50%</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>동적 스트레치에서 총 시간</td>
			<td>약 60분</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">젤 #3</td>
			<td>동적 스트레인 진폭(주파수 1Hz)</td>
			<td>동적 스트레치 지속 시간(분)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">0-30%</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>동적 스트레치에서 총 시간</td>
			<td>30분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 동적 스트레치 증명의 대표적인 결과. 3개의 젤이 실리콘 스트립에 내장되어 다양한 지속 시간 동안 동적으로(1Hz)로 뻗어 있었습니다. 균주는 0에서 30 % 이상의 다양한 크기까지 다양했습니다. 세 젤 모두 실리콘 스트립의 원형 컷아웃 의 내부 벽에 성공적으로 접착을 유지했습니다.

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Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.4K 조회수.  Tel-Aviv University. 제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

생물학

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

면역학 및 감염병학

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...