이 프로토콜은 동물 종의 다산 및 생물 다양성 보존에 중요한 유리화로 알려진 냉동 보존 기술을 통해 고양이 난모세포의 장기 보존에 유용합니다. 유리화의 주요 장점은 액체 질소를 사용할 수있는 경우 17 분 이내에 완료 할 수 있기 때문에 속도와 필드 조건에서의 타당성입니다. 국내 고양이는 야생 멸종 위기에 처한 고양이의 실행 가능한 모델입니다.
냉동 보존 프로토콜의 개발 및 최적화는 고양이 보존 프로그램을 위한 게임테 바이오뱅크를 설립할 수 있게 해 줄 것입니다. 한 줄에 세 개의 원뿔형 우물이 있는 Repro 진동판을 준비하여 시작합니다. 제1웰에 20마이크로리터의 평형 용액과 2차 및 세 번째 우물에 300마이크로리터의 진동용 액수를 추가합니다.
적정 한 oocyte 복합체 또는 COC를 평형하려면 작은 보어 파이펫을 사용하여 하나 이상의 복합체를 첫 번째 우물의 바닥으로 옮깁니다. 천천히 20 마이크로리터의 평형 용액을 드롭 테두리에 넣고 3분 간 기다린 다음, 240마이크로리터의 평형 솔루션을 추가하고 9분 동안 기다립니다. 기다리는 동안 액체 질소로 상자를 준비하고 실험 또는 고양이 식별 코드로 유리화 지지체에 라벨을 붙입니다.
스테레오 현미경 근처에 상자와 지원을 넣어. COC를 상화한 후 90초 이내에 진동을 수행합니다. COC를 진동시키기 위해 작은 보어 파이펫을 두 번째 우물에서 바이트화 용액으로 채웁니다.
첫 번째 우물의 바닥에서 COC를 가져 와서 두 번째 우물의 표면으로 이동합니다. 바이트화 용액으로 파이펫을 씻은 다음 COC를 우물의 다른 영역으로 이동하고 주변 용액을 혼합합니다. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 용액으로 채웁니다.
COC를 이동하고 주변 의 매체를 파이펫과 혼합합니다. 이 프로세스를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 세 번째 우물에서 바이트화 용액으로 파이펫을 세척하고 COC를 세 번째 우물의 바닥으로 이동하는 데 사용합니다.
다시, 주변 솔루션을 혼합. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 용액으로 채운 후 COC를 이동하고 솔루션을 혼합합니다. 이 프로세스를 반복합니다.
파이펫 팁을 우물의 다른 영역에서 바이트화 용액으로 채우고 팁 에 가까운 유리화 지지대스트립에 COC를 로드한 다음 초과 배지를 흡인시합니다. 즉시 액체 질소에 유리화 지원을 급락하고 그것을 닫기 위해 클램프를 사용하여, 그것은 침지 남아 있는지 확인. 로드된 유리화 지지대를 잔에 보관하고 온난화될 때까지 저장 액체 질소 탱크에 보관하십시오.
가열 단계를 스테레오 현미경에 가깝게 놓고 섭씨 38도로 켭니다. 페트리 접시뚜껑을 무대 위에 데운 다음, 유리화 지지대를 저장 탱크에서 액체 질소가 있는 상자로 옮습니다. 각 진동 지지체가 따뜻해질 수 있도록 Repro 플레이트 한 줄을 준비합니다.
제1웰에 300마이크로리터의 희석액을 추가하고 제2 및 세 번째 웰에 300마이크로리터의 세척 용액을 추가합니다. 해빙 용액을 인큐베이터에서 꺼내 페트리 접시 뚜껑에 100 마이크로리터를 떨어 뜨립니다. 클램프를 사용하여 액체 질소 내부의 진동 지원을 엽니다.
페트리 접시 뚜껑을 스테레오 현미경 아래에 놓고, 신속하게 유리화 지지대를 집어 들고 스트립을 드롭에 담그고 모든 COC가 분리 될 때까지 움직입니다. 비어 있는 즉시 드롭에서 지원을 제거하지만 COC를 해동 용액에 1분 동안 둡니다. 희석 용액으로 파이펫을 채우고 이를 사용하여 COC를 해동 용액 드롭에서 희석 용액으로 첫 번째 우물의 바닥으로 이동합니다.
3 분 동안 거기에 COC를 둡니다. 두 번째 잘 세척 용액으로 파이펫을 씻은 다음 COC를 가져 와서 두 번째 의 바닥으로 잘 옮겨 넣습니다. 5분 간 기다립니다.
파이펫을 세 번째 우물에서 용액으로 씻고 COC를 두 번째 우물에서 세 번째 우물의 표면으로 이동하는 데 사용합니다. COC가 세 번째 우물의 바닥을 만질 때까지 기다립니다. 그런 다음 다른 우물 영역으로 프로세스를 반복합니다.
완료되면 배양 매체로 파이펫을 씻고 난모세포를 문화 요리로 옮깁니다. 게임의 대부분은 이 프로토콜에 따라 난분염 진동과 온난화 후에 살아남습니다. 플루오레세인 디아세테이트와 프로피듐 요오드로 얼룩진 생존 가능한 유리화된 온난한 고양이 cumulus oocyte 복합체의 대표적인 사진이 여기에 표시됩니다.
이 표는 시험관 내 성숙을 위한 난온세포의 후온후 데이터를 묘사하는 시험화 후 생존의 비율을 보여줍니다. 435개의 난초 중 395개를 살아남았고, 온난화 후 생존능력은 90.8%를 기록했습니다. 그러나, 일부 형태학적 변화는 온난화 후 발견 될 수있다.
가장 빈번한 형태학적 이상은 ooplasm 모양과 과립의 변화, 적운 세포의 부분적 또는 때로는 총 손실, 및 조나 펠루시다 골절입니다. 이 절차를 시도할 때, 사용 전에 올바른 온도가 되도록 미디어를 미리 준비하고 세포 독성을 피하기 위해 프로토콜 온도와 타이밍을 따라야 합니다. 프로토콜은 또한 다른 종의 난모세포에 적용될 수 있었습니다.
성공하면 멸종 위기에 처한 고양이의 생물 다양성 보존을 위한 세균 플라스엠 뱅킹에도 기여할 수 있습니다.
