이 방법은 연구원이 미토콘드리아 기능의 독립적으로 세포 생존가능성을 평가할 수 있게 합니다. 그리고 높은 처리량 약물 검사 노력에 순종적이다. 이 기술은 빠르고 정확하며 저렴하며 대부분의 세포 유형에서 미토콘드리아 기능을 손상시키는 화합물 세포 독성을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 수행하기 쉽습니다. 실험적 정확성과 유효성을 보장하기 위해 약물 제제, 치료 조건 및 세포 밀도에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 특히 Gen5 Software에 대한 경험이 거의 없는 연구자의 경우 이미지 수집 및 이미지 분석 단계를 재현하기 어려울 수 있기 때문에 이 방법의 시각적 데모가 중요합니다.
원하는 농도에서 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비 하 여 시작. 항상 철저하게 소용돌이하여 화합물을 혼합해야합니다. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 2배 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.
화합물 조합의 세포 독성을 측정하는 경우 4배 의 최종 농도로 준비하십시오. 동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 세포 현탁액의 15 밀리리터 원내 튜브와 알리쿼트 10 마이크로리터로 세포를 수집합니다.
트라이판 블루 염색의 경우, 알리쿼트에 0.4%의 트라이판 블루 10마이크로리터를 추가하고 혈전계 또는 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포와 실행 불가능한 세포를 계산합니다. 15 밀리리터 튜브의 펠릿 세포는 5 분 동안 200 회 G에서, 다음 흡인 또는 슈퍼 나탄을 배출. 우리는 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 3 배 10의 세포 밀도에서 에세이 적절한 매체에서 세포 펠릿을 일시 중단합니다.
멀티 채널 파이펫을 사용하여 50 마이크로리터의 셀 서스펜션을 96웰 플레이트의 각 웰에 시드합니다. 단일 화합물 어필의 경우 각 웰에 2X 화합물 용액 50 마이크로리터를 추가하십시오. 용매 제어 우물의 경우 용매를 2배 농도로 포함하는 테스트 매체 15마이크로리터를 추가합니다.
조합 된 소의를 위해 각 4X 화합물의 25 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다. 단일 복합 제어 웰의 경우 각각 25마이크로리터를 4X 화합물 용액과 테스트 배지를 추가합니다. DMSO의 최종 농도가 0.5%를 초과하지 않도록 재현성을 보장하고, 우물의 측면을 만지는 파이펫 팁으로 약물을 추가하십시오.
다른 위치에 약물을 추가 하는 신중. 이 찌르기는 바람직하게는 플레이트 당 30 분 이상 복용, 매우 빠르게 수행해야합니다. 접시를 부드럽게 탭하여 우물의 내용을 섞어 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 배양합니다.
Hoechst 33342및 propidium 요오드로 세포를 염색할 준비가 되면 신선한 10X 염색 용액을 준비하고 각 웰에 10 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 부드럽게 누르고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 플레이트의 바닥에 모든 세포를 가져오기 위해 4 분 동안 200 배 G에서 플레이트를 원심 분리합니다.
그런 다음 젖은 실험실 닦아서 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦아 이미징을 방해 할 수있는 파편을 제거하십시오. 원심분리 후 15분 이내에 플레이트를 이미지화합니다. Gen5 소프트웨어를 열고 새 표준 프로토콜을 만들고 절차를 클릭하고 사용할 플레이트 유형을 선택합니다.
보통, 96 잘 검은 플라스틱 접시. 다음으로 읽기 메서드를 이미지로 설정하고 Okay를 클릭하고 4배 배율 목표를 가진 DAPI 및 텍사스 레드 필터 세트를 선택합니다. 웰 센터가 이미지화되므로 오프셋이 필요하지 않습니다.
DAPI 필터의 경우 LED를 10으로 설정하고 통합 시간을 99로 설정하고 0으로 가져옵니다. 텍사스 레드의 경우 LED를 8로 설정하고 통합 시간을 950으로 설정하고 18로 증가합니다. 옵션을 클릭하여 DAPI 채널에서 자동 포커스가 수행되고 채널 간에 초점을 맞추는 데 오프셋이 없는지 확인합니다.
좋아요를 클릭하여 프로토콜을 저장합니다. 이제 새 읽기 단추를 사용하여 이미지를 기록할 수 있습니다. 이미지가 녹화되면 데이터 감소를 클릭하고 이미지 전처리를 선택합니다.
DAPI 신호를 기반으로 자동 병합 크기를 사용하여 어두운 배경 빼기로 이미지 전처리를 적용합니다. 텍사스 레드의 경우 채널 1과 동일한 옵션을 사용합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다.
그런 다음 셀룰러 분석 패널로 이동하여 6, 000 단위의 임계 값, 최소 물체 크기 5 마이크로미터 및 25 마이크로미터의 최대 물체 크기로 변형된 DAPI 신호를 기반으로 핵 마스크를 적용합니다. 전체 이미지를 분석하고 이미지 테두리의 기본 가장자리 개체를 배제하고 터치 오브젝트를 분할합니다. 고급 감지 옵션에서는 롤링 볼 직경을 30 마이크로미터로 설정하고 가장 낮은 픽셀의 5%를 기준으로 배경을 평가합니다.
셀 수를 계산된 메트릭에만 유지합니다. 그 후, 죽은 세포를 계산하기 위해 5, 000 단위의 임계 값으로 변형 된 텍사스 적 신호 평균에 기초하여 하위 집단 분석을 수행합니다. 마지막으로 결과 셀 수에 액세스합니다.
Hoechst, 프로피듐 요오드로 염색 된 세포의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포의 총 수는 합리적으로 높고 죽은 세포의 수보다 큽습니다. 세포 독성 분석의 패널이 트라이판 블루 배제와 비교되었을 때, MTT와 알라마르 블루 분석이 셀룰러 생존가능성을 부정확하게 측정한 것으로 나타났습니다.
이러한 미토콘드리아 효소 기반 분석제는 트라이판 블루 제외에 비해 생존가능성이 현저히 낮았다. Hoechst 33342 및 PI를 이용한 이중 염색은 CCP 또는 2-DG 처리 후 트라이판 블루 스테인링과 트라이판 블루 배제 방법에서 가장 작은 중앙 편차와 견고성, 감도 및 일관성의 최상의 조합을 가졌다. Hoechst PI 에세이는 또한 분자 로테네네와 3개의 브로모피라바테를 표적으로 하는 미토콘드리아를 대상으로 처리 후에 세포 생존가능성을 결정하는 데 효과적이었습니다.
그것은 백혈병 세포주 패널로 더 검증되었다. 이 세포는 저항 세포에 아주 과민한에서 구역수색하는 로테네감에서 변화했습니다. 분석의 부적절한 성능은 정확도를 손상시킬 수 있습니다.
몇 가지 손상된 결과가 여기에 표시됩니다. PI로 과도하게 스태킹하거나 원심분리 단계를 무시하거나 Hoechst 채널의 과다 노출로 인해 최적이 아닌 결과가 발생합니다. 이 프로토콜의 타이밍동안 각 세포주에 대한 염료 농도 및 염색 시간을 최적화해야합니다.
또한, 샘플 플레이트에 대한 중심화는 이미징 품질을 보장하기 위해 필요합니다. 암세포에 대한 세포 독성 효과의 화합물을 식별 한 후, 연구원은 그들의 관련 목표를 식별 하기 위해 기계적인 연구와 함께 진행할 수 있습니다. 기존의 MTT assays와 병행하여 이 기술을 가진 소분자 라이브러리를 스크리닝하면 미토콘드리아 기능을 표적으로 하는 분자가 빠르게 식별될 수 있습니다.
