세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

섬유의 현재 프로토콜 평가자, 레독스 상태는 세포내 구획 별 방식으로 변경됩니다. 우리의 프로토콜은 산화 스트레스의 모든 생리적 또는 병리학 적 메커니즘을 더 잘 이해하고 모니터링 할 수 있습니다. 이 기술은 비비율 메트릭 출력을 사용하여 그대로 세포에서 타일 눈 황화물 비율의 비파괴 적정화를 허용하여 신호 발현 수준, 사진 표백 및 검출 민감도 사이의 차이를 상쇄할 수 있습니다.

이 프로토콜은 식물에 있는 박테리아를 포함하여 각종 유기체에 적용될 수 있습니다. 실험의 첫날에 2 분 동안 동천성 유방암 세포주에서 세포를 치료하고, EDTA에서 0.2, 5 %의 2 밀리리터를 가진다. 세포가 분리되기 시작하면 완전한 배지및 퇴적물의 6밀리리터로 세포를 원심분리에 의한 반응을 체포한다.

신선한, 완전한 매체의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 세포를 계산하고 완전한 매체의 1 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 1.5 배 10으로 희석합니다. 그런 다음 6웰 플레이트에서 잘 세포의 밀리리터 당 5 번째 세포당 1.5 배 10을 시드하고, 하룻밤 동안 세포 배양 배양에서 세포를 배양한다. 또는 바이러스 성 행 GFP 변환을 추가하지 않습니다.

다음 아침, 12.5, 25 및 50 마이크로리터를 1-100의 마이크로리터를 10번 10번 희석하여 밀리리터당 10번째 플라크 성형 유닛에 완전한 배지에 바이러스 침식 GFP 용액을 첨가하지 않는다. 각각 50, 100 및 200 복합 감염으로 세포를 변환하기 위해 적절한 우물 또는 6 웰 플레이트에 추가합니다. 모든 샘플 웰스가 바이러스로 변환되면 세포를 세포 배양 인큐베이터로 16~24시간 동안 되돌려 보입니다.

다음 날, 형광 현미경 검사법에 의해 세포를 시각화하고 세포가 추가 24 시간 동안 복구 할 수 있도록 바이러스없이, 매체로 상체를 대체. 최적의 유도 효율을 결정하기 위해 세포측정을 유동하여 세포의 형광 강도 및 형태학을 평가합니다. 생물 안전 수준 2 인증 생물학적 안전 캐비닛 내에서 에어로졸 또는 스플래시에서 감염을 일으킬 수있는 모든 절차를 수행해야합니다.

세포의 레독스 상태를 평가하기 위해, 다음 아침, 1시간 동안 10 마이크로몰라 수소와 함께 6웰 플레이트의 세포와 적절한 우물을 배양한 후 EDTA에서 0.2 5%의 750 마이크로리터로 세포를 분리하는 것으로 입증되었다. 잘 당 완전한 매체의 두 밀리리터와 반응을 중지하고 개별 15 밀리리터 원판 튜브에서 각 조건에 대한 슈퍼 나츠를 당깁니다. 원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 500마이크로리터의 PBS를 두 번 원심분리하여 잘 씻어낸다.

두 번째 세척 후, 40 마이크로 미터 의 메스를 통해 세포 현탁액을 빛으로부터 보호된 얼음의 유세포 측정 호환 튜브로 필터링합니다. 흐름 사이토미터 소프트웨어에서 감염 제어 샘플의 0 복합성을 실행합니다. 그런 다음 과산화수소 및 처리되지 않은 세포를 분석합니다.

표시된 바와 같이 수식을 사용하여 산화된 행 GFP 의 감소된 형태 사이의 평균 형광 강도 비율을 계산할 수 있습니다. 다음은 유동 세포측정에 의한 다수의 세포를 선택하기 위한 게이팅 전략이 도시된다. 유동 세포측정은 또한 행 GFP 분석에 대한 용량 반응 곡선과 감염 입력의 가장 효율적인 복합성을 결정하는 데 사용될 수 있다.

감염의 복합성에 따르면, 이 대표적인 분석에서 투여량 반응 곡선, 감염의 200 복합성은 가장 높은 도로 GFP 발현을 주었지만, 세포 형태는 세포 독성을 시사하는 효과가 있었다. 따라서 최적 전환 효율은 100의 감염의 복합성으로 결정되었다. 이러한 레독스 상태 분석에서, 산화 및 감소행 GFP는 차량에 대한 유동 세포측정 분석에서 형광 강도를 획득하고 4개의 10마이크로몰러 양성 제어 과산화수소 치료제를 얻었다.

중첩 된 히스토그램은 과산화수소 10 마이크로 몰라 및 차량 처리 그룹 또는 감소 및 산화 침식 GFP에서 세포 수의 변화를 나타냅니다. 이 분석을 위해 산화 및 감소행 GFP 사이의 비율을 계산한 결과, 과산화수소 10개가 차량 처리에 비해 행 GFP의 산화를 3배 증가시킨 것으로 나타났다. 정확한 셀 번호를 갖는 것은 MRI 계산 및 재현성에 중요합니다.

재현 가능한 결과를 얻으려면 연구자들은 항 바이러스 솔루션을 철저히 혼합하여 균일한 현탁액을 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 연구원이 정상 세포 프로세스및 질병 진행의 광범위한 부분의 필수적인 부분으로 급속한 redox 변경을 실시간으로 연구할 수 있게 합니다.