우리의 프로토콜은 식물 추출물에서 활성 분자의 분리 및 정제에 대한 새로운 발견을 설명합니다. 과학자들은 이러한 방법을 사용하여 치료 사용자를 위한 천연 제품 소스에서 작은 분자와 펩티드를 분리할 수 있습니다. 계측기 구성 요소와 조립 방법에 익숙해지십시오.
분리할 샘플은 제안된 지침에 의해 제조되는 것이 중요합니다. 이 메서드는 계측기의 여러 조립 프로세스를 포함 합니다. 그리고 시각적 데모는 사용자가 따라 성공적으로 연구에 적용하는 데 도움이됩니다.
액체 상을 조립한 후, IEF 장치는 사용 설명서에 기재된 바와 같이, 0.1 어금강 나트륨 수산화및 양이온 교환 막을 0.1 의 어금강산으로 양화하여 음이온 교환 막을 평형화한다. 고무 개스킷을 정렬하여 3개의 큰 직사각형 구멍이 고무에 의해 차단되지 않도록 합니다. 이것은 전기 전염 도중 막을 통해 전극과 견본 구획 사이 이온을 교환하는 것을 도울 것입니다.
이온 교환 개스킷에 3개의 직사각형 구멍을 정렬하여 전극의 내부 및 외부 부분을 조립합니다. 그런 다음 전극을 각각의 전해질로 채우면 멤브레인이 건조되는 것을 방지하십시오. 다음으로 플라스틱 나사 홀더를 조여 누출 방지 조립을 보장합니다.
샘플 수집 보드를 밀봉 테이프로 덮습니다. 다음으로 다음 순서로 세라믹 냉각 손가락 위에 초점 챔버의 부분을 조립 : 양극 전극, 나일론 멤브레인 코어, 초점 챔버 및 음극 전극. 50 밀리리터 주사기를 사용하여, 미리 냉각 된 증류수로 초점 챔버를 채웁니다.
표준 IEF 셀의 경우 60 밀리리터의 물을 추가합니다. IEF 장치를 섭씨 4도에서 순환 냉각수에 연결합니다. 전압이 안정될 때까지 약 3~5분 동안 15와트 및 3000볼트로 장치를 작동합니다.
그런 다음 전원을 끕다. 분수 수집기를 사용하여 셀에서 물을 제거합니다. 밀봉 테이프로 컬렉션 보드를 다시 밀봉합니다.
0.6 그램의 Gymnema sylvestre 식물 추출물을 증류수 60 밀리리터에 추가하십시오. 롤러 튜브에 5분 동안 혼합하여 식물 추출물을 녹입니다. 불용성 입자를 제거하려면 이 용액을 5분 동안 10, 000배 G로 원심분리합니다.
150 밀리리터 유리 비커로 상체를 옮기고 앰프를 추가하여 볼륨별로 1%의 용액을 만듭니다. 1.5 인치 19 게이지 무딘 엔드 바늘이있는 50 밀리리터 주사기를 사용하여 샘플 수집 보드를 통해 이 솔루션을 IEF 셀에 로드합니다. 그런 다음 스탠드에서 셀을 제거하고 전극 챔버를 탭하여 거품을 제거하고 제거합니다.
장치를 냉각수에 연결합니다. 일정한 15 와트에 전원 공급 장치가 분수 시작. 전압이 일정한 값에 도달할 때까지 약 3시간 동안 IEF 장치를 실행합니다.
버튼을 누르면 분수 수집핀을 컬렉션 보드와 정렬합니다. 밀봉 테이프를 통해 핀을 밀어 짐네마 실베스트레 분획을 수집하기 시작합니다. C.albicans와 효모 펩티톤 덱스트로스 국물의 단일 식민지를 밤새 섭씨 30도에서 흔들어.
배양을 원심분리기 튜브로 옮기고 5분 동안 10회, 000회 G에서 원심분리로 효모 세포를 수집한다. 상체를 제거한 후, 효모 세포를 완충제로 중단하고 5°C에서 1시간 동안 롤러튜브에서 서스펜션을 회전시한다. 효모 세포를 제거하기 위해 서스펜션을 5 분 동안 10, 000 배 G로 원심 분리합니다.
그런 다음 0.45 마이크로미터 필터를 통해 단백질 추출물을 필터링합니다. 단백질 추출물을 투석 튜브로 옮기고 4°C에서 15시간 동안 물에 투석을 합니다. 단백질 농도를 추정한 후 총 단백질 500밀리그램을 함유한 단백질 추출물을 수집합니다.
500 밀리그램의 단백질을 60 밀리리터의 물에 희석시켜 1%ampholyte를 함유합니다. 주사기를 사용하여 희석된 단백질 추출물을 IEF 세포에 적재하고 4시간 동안 일정한 15와트로 장치를 작동시합니다. 이 계측기는 고전압 전기 공급을 사용하기 때문에 사용자는 라이브 전극과의 직접적인 접촉을 피하기 위해 모든 예방 조치를 취해야합니다.
분수 수집기에는 20개의 플라스틱 튜브가 포함되어 있으며, 각각 12밀리미터x 75밀리미터가 들어있습니다. 그리고 그것은 진공 펌프에 연결되어 있습니다. 버튼에 수확을 눌러 분수를 수집 할 준비합니다.
그런 다음 분획 수집기의 20개의 컬렉션 핀을 20개의 수집 보드와 정렬하여 밀봉된 초점 셀을 정렬합니다. 밀봉 테이프를 통해 컬렉션 핀을 밀어 동시에 진공 펌프를 켭니다. 각 튜브는 약 3 밀리리터의 단백질 분수를 수집합니다.
단백질 분획을 줄이고 끓인 후 12.5%SDS 페이지 젤로 분석합니다. 쿠마시 블루 염료로 젤을 염색하고 실온에서 로커에 놓습니다. 2 ~3 시간 후에 젤을 디스테인.
그런 다음 젤 이미저를 사용하여 젤 이미지를 기록합니다. 50 밀리몰러 포도당으로 보충된 RPMI 세포 배양 배지에서 1:1000 비율로 C.albicans의 하룻밤 배양을 희석하여 효모 세포 현탁액을 준비합니다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 90 마이크로 리터를 추가합니다.
다음으로 각 G.sylvestre 분획의 마이크로리터 10개를 추가하여 우물을 분리합니다. 음의 대조군으로서 10 마이크로리터의 물을 별도의 우물에 1%amp홀리트로 넣습니다. 12 시간 동안 섭씨 37도에서 96 웰 플레이트를 배양 한 후 현미경으로 플레이트를 관찰하십시오.
필라멘트 성장의 부족은 C.albicans 효모-hypha 변환의 억제를 나타냅니다. G.sylvestre 추출물의 20분은 액체 상 IEF에 의해 수득되었다. 어두운 색깔의 분자, 체육관 산은, 이동하고 장치의 양극 끝에 풍부했다.
음극 끝에서 반투명 라이트 노란색 분획이 관찰되었습니다. 각 G.sylvestre 굴절의 알리쿼트(Aliquots)는 SDS 페이지에서 감소, 삶기 및 해결되었습니다. 쿠마시 블루 스테인은 약 5킬로달톤에서 다른 폴리펩티드 밴드를 보여주었으며, 16-19까지분수로 농축되었다.
분수 하나에 있는 Gymnemic 산, 그리고 그(것)들이 단백질이 아니기 때문에 다음 몇몇 분수는 검출되지 않았습니다. 그러나, 이러한 분자는 TLC에 의해 분리되고 UV 빛 하에서 검출될 수 있다. 분수 10 유기 작은 분자의 대부분이 분수 1 ~3에서 농축되었다는 것을 건의하는 이 작은 분자의 검출 가능한 양을 포함하지 않았습니다.
모든 20 G.sylvestre 분획은 C.albicans에서 효모 -hypha 변환 및 최면 성장의 억제를 위해 분석되었다. 가장 큰 억제는 분수 10 이상에서 관찰된 거의 또는 전혀 억제되지 않은 분수에서 관찰되었다. C.albicans에서 세포 표면 단백질액체 상 IEF를 사용하여 분별되었다.
그리고 18분별에서 알리쿼트S를 SDS 페이지에 의해 분석되었다. 농축 된 단백질은 여러 분수에서 볼 수 있었습니다. 시작, 작은 분자는 비 외래로 믿어지기 때문에 등전기 초점에 의해 분리 될 수 없습니다.
우리의 연구 결과는 그(것)들이 외래, 적어도 매주, 및 이 방법은 그밖 작은 분자를 위해 더 탐구될 수 있다는 것을 보여줍니다.
