我々のプロトコルは、植物抽出物からの活性分子の分離と精製に関する新しい知見を記述する。科学者は、これらの方法を使用して、治療薬のユーザーのための天然物源から小分子およびペプチドを分離することができます。計測器コンポーネントとそのアセンブリ方法について理解してください。
分離するサンプルは、提案されたガイドラインによって調製されることを確認することが重要です。このメソッドには、計測器の複数のアセンブリプロセスが含まれます。そして、視覚的なデモンストレーションは、ユーザーがフォローし、正常に研究にそれらを適用するのに役立ちます。
液相を組み立てた後、取扱説明書に記載したIEFユニットは、0.1モル水酸化ナトリウムと0.1モルリン酸のカチオン交換膜でアニオン交換膜を平衡化する。3つの大きな楕円形の穴がゴムによってブロックされないままになるように、ゴム製のガスケットを整列します。これは、電気泳動中に膜を介して電極とサンプルコンパートメントの間でイオンを交換するのに役立ちます。
イオン交換用ガスケット内の3つの楕円形の穴を合わせることで、電極の内側と外側の部分を組み立てます。その後、それぞれの電解質を電極に充填して、膜が乾燥するのを防ぎます。次に、プラスチック製のネジホルダーを締めて、漏れのないアセンブリを確保します。
サンプル収集ボードをシーリングテープで覆います。次に、次のシーケンスでセラミック冷却指の上に集電室の部品を組み立てます:アノード電極、ナイロン膜コア、集光室およびカソード電極。50ミリリットルのシリンジを使用して、あらかじめ冷却された蒸留水で焦点チャンバーを満たします。
標準的なIEFセルの場合は、60ミリリットルの水を加えます。IEFユニットを摂氏4度で循環冷却水に接続します。電圧が安定するまで、約3〜5分で15ワットと3000ボルトでユニットを操作します。
次に、電源をオフにします。分数コレクターを使用して、セルから水を取り除きます。シーリングテープで回収板を再密封します。
0.6 ジメナシシルヴェストル植物エキスのグラムを追加します, 蒸留水の60ミリリットルに.ローラーチューブに5分間混合して植物抽出物を溶解します。不溶性粒子を除去するために、この溶液を5分間Gの10,000倍に遠心する。
上清を150ミリリットルのガラスビーカーに移し、アンプホーレを加え、体積で約0.6ミリリットルの1%溶液を作り出します。1.5インチ19ゲージの鈍い端の針と50ミリリットルのシリンジを使用して、サンプル採取板を通してIEFセルにこの溶液をロードする。次に、スタンドからセルを取り出し、電極室をタップして、気泡を取り除いて取り除きます。
冷却水にユニットを接続します。電源を一定に15ワットで分画を開始します。電圧が一定の値(約3時間)に達するまでIEFユニットを実行します。
ボタン上の収穫を押した後、分数のコレクターピンをコレクションボードに合わせます。シーリングテープを通してピンを押して、ジムネマシルヴェストルの分数の収集を開始します。C.albicansと酵母ペピトンデキストローススープの単一コロニーを摂氏30度で一晩揺れで育てる。
培養物を遠心分離管に移し、10,000倍Gで5分間遠心分離して酵母細胞を採取する。上清を取り除いた後、酵母細胞を緩衝液に吊り下げ、ローラーチューブで5度で1時間回転させます。酵母細胞を除去するために、懸濁液を10,000倍Gで5分間遠心する。
その後、0.45マイクロメートルのフィルターを介してタンパク質抽出物をフィルタリングします。タンパク質抽出物を透析チューブに移し、水に対して水に対して摂氏4度で15時間移動します。タンパク質濃度を推定した後、500ミリグラムの全タンパク質を含むタンパク質抽出物の体積を収集する。
500ミリグラムのタンパク質を、1%アンプリルテを含む水の60ミリリットルで希釈します。注射器を使用して、希釈したタンパク質抽出物をIEF細胞にロードし、一定の15ワットで4時間操作します。この装置は高圧電源を使用するため、ユーザーは、ライブ電極との直接接触を避けるために、すべての予防措置を講じる必要があります。
分数コレクターは20のプラスチック管、それぞれ12ミリメートルx 75ミリメートルが含まれています。そして、それは真空ポンプに接続されています。ボタンの収穫を押して分数を収集する準備をします。
次に、20個のコレクションピンを20個のコレクションボードに合わせて、密閉されたフォーカスセルを使用します。回収ピンをシーリングテープに押し込み、同時に真空ポンプをオンにします。各チューブは約3ミリリットルのタンパク質分画を収集します。
タンパク質の分率を減らして沸騰させた後、12.5%SDSページゲルで分析します。クーマシーブルー染料でゲルを汚し、室温でロッカーに置きます。2〜3時間後にゲルをデステインする。
次に、ゲルイメージャーを使用してゲル画像を記録します。50ミリモルグルコースを添加したRPMI細胞培養培地中で1:1000比でC.albicansの一晩培養を希釈することにより、酵母細胞懸濁液を調製する。96ウェルプレートの各ウェルにセルサスペンションの90マイクロリットルを追加します。
次に、各G.sylvestre分率の10マイクロリットルを別々の井戸に加えます。負のコントロールとして、1%アンプリルテで10マイクロリットルの水を別々の井戸に加えます。96ウェルプレートを摂氏37度で12時間インキュベートした後、顕微鏡でプレートを観察します。
糸状成長の欠如は、C.アルビカンス酵母からヒュファへの変換の阻害を示す。G.sylvestre抽出物の20分の一部は、液相IEFによって得られた。暗い色の分子、ジムネミック酸は、ユニットのアノード端に移動し、濃縮された。
半透明の淡黄色の画分は、カソード末端で観察された。各G.sylvestre屈折からのアリコートは、SDSページによって減少し、沸騰し、解決された。クマシーブルー染色剤は、約5キロダルトンで異なるポリペプチドバンドを示し、画分16〜19で濃縮した。
分数1のジムネミック酸は、タンパク質性がないため、次の数画分は検出されなかった。しかし、これらの分子はTLCによって分離され、UV光下で検出することができる。画10は、これらの小分子の検出可能な量を含み、有機小分子のほとんどが1〜3分の1で富化されたことを示唆した。
全20 G.シルヴェストル分画は、C.albicansにおける酵母からヒュファへの変換および催眠増殖の阻害についてアッセイした。最大の阻害は、画分10以上では認められなかった1分の1とほとんどない阻害で観察された。C.albicansの細胞表面タンパク質を液相IEFを用いて分画した。
そして、18分の一部からのアリコートをSDSページで分析した。濃縮タンパク質は、いくつかの分数で見えました.始めに、小分子は非歩行性であると考えられているため、等電焦点によって分離することができなかった。
我々の研究は、彼らが少なくとも毎週、歩行的であることを示しており、この方法は、他の小分子のためにさらに探求することができます。
