C.elegans에서 폴리글루타민 형광 기자의 조직 별 발현의 사용은 그대로 다세포 유기체의 맥락에서 프로테오스타증 조절기의 발견과 특성화를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 세포 프로테오스타증의 노화와 관련된 쇠퇴의 시각화 및 정량화를 허용한다는 것입니다. 프로테오스타증을 보존할 수 있는 유능메커니즘은 프로테오스타증이 손상된 노화 관련 질환의 치료를 위한 표적 개입의 개발을 용이하게 하고 건강한 노화를 촉진할 것이다.
프로테오스타증 붕괴는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 을 포함한 단백질 오접기 질환의 발병의 근간을 뒷받침하기 때문에 대규모 클리닉 문제입니다. 먼저 6센티미터 직경의 페트리 플레이트를 사용하여 각 테스트 조건에 대해 5개의 한천 판을 준비합니다. RNAi를 사용한 실험을 위해 변형된 HT115 E.coli에서 dsRNA 생산을 유도하고 RNAi 한천을 사용하십시오.
RNAi없이 실험에 대한 표준 NGM 한고에 OP50 대장균을 사용합니다. 220 RPM에서 흔들면서 하룻밤 사이에 대장균 문화를 섭씨 37도에서 성장시다. 다음 날, 15~20분 동안 2, 400G에서 원심분리로 박테리아를 펠릿한 다음, 수퍼나탄을 흡인하고 골릿을 lb의 시작 량의 10분의 1에서 다시 중단시합니다.
Aliquot 200 마이크로리터의 농축 된 박테리아는 각 플레이트에 모든 액체가 흡수 될 때까지 깨끗한 환경에서 열면 플레이트를 건조 할 수 있습니다. C.Elegans와 하이포클로라이트 트리트먼트를 동기화하려면 중력 헤르마프로디트를 M9 버퍼와 두 번 세척한 다음 신선한 튜브로 옮기고 5밀리리터의 하이포클로라이트 용액을 5밀리리터로 배양하여 매 분마다 흔들어 보냅니다. 인큐베이션 후, 동물을 스핀 다운하고 M9 버퍼로 세 번 세척합니다.
배아는 섭씨 20도에서 회전하는 M9 용액 3 밀리리터에서 하룻밤 동안 튜브에서 부화할 수 있도록 합니다. L1 용액 10마이크로리터를 6센티미터 플레이트에 세 번 떨어뜨리고 L1 동물의 수를 계산하여 L1 동물의 밀도를 계산합니다. 주기적으로 L1 솔루션을 혼합하여 동물이 정착하지 못하도록 합니다.
씨앗 50 L1 각 접시에 하나의 동물을, 카운트 및 시드 번호를 기록하고, 20섭씨 인큐베이터로 판을 이동합니다. 또는, 계란 누워를 통해 동물을 동기화하려면, 4 ~ 6 시간 동안 각 접시에 5 ~ 10 젊은, 중력 성인 동물을 배치하고 접시 당 약 50 계란이있을 때까지 계란을 낳을 수 있도록. 모든 중력 성인을 제거하고 계란과 접시를 20섭씨 인큐베이터로 이동합니다.
섭씨 20도에서 약 40시간이 걸리는 L4 단계까지 동물을 키우십시오. 그런 다음 FUDR의 160배의 50마이크로리터를 추가합니다. 근육 조직에서 프로테오스타증의 감소를 측정하려면 20마리의 동물을 선택하고 3%의 아가로즈 패드와 10밀리올라 나트륨 아지드의 5 마이크로리터 드롭을 장착한 현미경 슬라이드에 장착하십시오.
모든 웜이 고정된 후 10 X 배율 렌즈를 사용하여 동물의 몸 전체를 이미지합니다. FITC 또는 YFP 필터와 모든 동물에 대해 동일한 노출을 사용합니다. 완료되면 슬라이드를 폐기합니다.
전체 동물의 신체 벽 근육에 있는 foci의 수를 계산합니다. Foci는 백그라운드의 조광 용해 신호와 차별화될 수 있는 더 밝은 구두점 신호입니다. 점수 매기기 일에, 동물과 접시를보고 마비 동물의 수를 기록 한 다음 접시에서 마비 된 동물을 제거합니다.
실험이 완료되면 각 상태에 대한 마비 속도를 계산하고 마비 진행을 플롯합니다. 신경 조직에서 프로테오스타증의 감소를 측정하기 위해, 이전에 설명한 대로 슬라이드에 벌레를 장착하고 40 X 배율 렌즈를 사용하여 복합 현미경에 동물의 머리의 Z 스택 이미지를 가져 가라. 이미징 후 슬라이드를 삭제합니다.
이미지를 수집 한 후 Z 스택을 평평하게하고 신경 링 영역에있는 뉴런의 포시 수를 정량화하는 데 사용합니다. 4일, 6일, 8일, 10일부터 YFP 포치 축적의 진행을 플롯한다. 성인기 둘째 날에는 접시에서 동기화된 동물 10마리를 선택하고 현미경 슬라이드에 M9 버퍼 10마이크로리터 드롭에 놓습니다.
40개 이상의 동물의 샘플을 얻으려면 이 단계를 적어도 4번 반복하십시오. 비디오는 비디오 지원 카메라와 스테레오 현미경에 30 초 동안 동물의 움직임을 기록합니다. 분석할 동물과 함께 모든 비디오가 녹화되면 비디오를 재생하고 각 동물의 신체 굴곡을 점수.
각 점이 Y 축에서 30초 만에 구부러지는 수와 X 축에서 테스트된 다른 조건을 나타내는 컬럼 그래프에서 각 동물의 바디 굽힘 수를 플롯합니다. 폴리글루타민 반복 모델은 전립선 성 네트워크를 조절하는 유전자의 식별에 중요한 역할을하고있다. 근육별 polyQ-YFP 발현은 단순한 형광 해부 현미경하에서 정량화하기 쉬운 형광 포시의 축적을 초래합니다.
동물은 중년 도중 마비되고, 근육 내의 프로테오메는 기자의 프로테오독성 효과때문에 붕괴됩니다. 신경 프로테오스타증의 노화와 관련된 감소는 동물을 액체로 배치한 후 조정된 신체 굴곡에서 직접 골재 형성및 감소를 정량화하는 것으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 동종 도메인상호작용 단백질 키나아제, 전사 공동인자, 자가식 및 분자 보호자의 발현을 조절하여 노화 시 프로테오스타증에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해 사용되어 왔다.
HPK-1의 손실은 노화 시 축적되는 Q35-YFP 집계 수를 증가시킵니다. 대조군 동물은 평균 18개의 응집체를 표시했으며, HPK1 널 돌연변이및 HPK1 RNAi 처리동물은 각각 평균 28및 26개의 골재를 표시했습니다. 성인 8일째까지 HPK1 결핍 동물의 77~78%가 마비되었으며, 대조군의 50%에 불과했습니다.
또한, HPK1의 과발현은 노화 중 Q35-YFP 관련 마비로부터 단백질 골재 형성을 조절하고 노화동물을 보호하는 것으로 나타났다. 이 방법은 세포 유형 내에서 프로테오메의 일반적인 감소를 측정합니다. 프정성 네트워크의 특정 구성 요소의 변경 사항을 평가하기 위한 많은 방법이 존재합니다.
함께, 그들은 포괄적 인 그림을 제공합니다. 프로테오스타증 감소는 노화의 특징입니다. 이 접근은 연구원이 이 쇠퇴를 정량화하는 것을 허용합니다.
유전자 분석과 결합하면 발견을위한 강력한 도구입니다.
