연구는 JAG에 NHLBI 연구 과학자 개발 보조금 (1K01HL135461-01)에 의해 지원되었다. David Carmona-Berrio와 Isabel Adarve-Rengifo의 기술 지원에 감사드립니다.

마우스는 밴더빌트 대학 의료 센터 (VUMC) 동물 관리 부서 국립 보건원 (NIH) 지침과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드, 미국 보건 복지부에 따라 보관되고 보살핌을 받았다. 모든 동물 절차는 실험을 시작하기 전에 VUMC 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 준비 및 해부
<ol><li>수술을 시작하기 약 30 분 전에 가열 패드의 발아기와 워터 펌프를 켭니다.</li>
	<li>날카로운 메스로 0.5mm 길이의 폴리 우레탄 튜브를 자릅니다. 커프를 만들기 위해 길이 방향으로 절단하여 둘레의 0.2mm를 제거하십시오. 참고 : 이것은 극도의 정밀도, 세부 사항 및 인내심에 대한 관심을 필요로하는 신장 동맥 협착 절차의 중요한 부분입니다. 한 번에 여러 조각의 폴리 우레탄 튜브를 자르십시오. 이 모든 절차를 현미경으로 수행하십시오.</li>
	<li>더 이상 진행하기 전에 외과 용 멸균 장갑과 외과 용 마스크를 착용하십시오.</li>
	<li>6-8 주간의 C57BL / 6 야생형 (WT) 마우스를 사용하십시오. 성별 편견을 피하기 위해 동일한 수의 수컷과 암컷 마우스를 사용하십시오.</li>
	<li>수술을 수행하기 전에 마우스의 무게를 기록하십시오. 폴리 우레탄 튜브로 신장 동맥 협착을 수행하는 이상적인 무게는 18-22g입니다. 마우스를 부드럽게 처리하고 마취를 주입하는 동안 교반하지 마십시오. 수술 전 진통을 투여하십시오 (Ketofgen, 5 mg / kg body wieght). 참고 : 생쥐를 숙소실에서 수술실로 옮기는 동안 동요를 피하기 위해 매우 온화하고 조심스럽게 운반하십시오. 트롤리 대신 쥐 케이지를 손에 들고 다니는 것이 좋습니다.</li>
	<li>복강 내 주사를 통해 케타민 (100 mg / kg BW)과 자일라진 (10 mg / kg BW)의 혼합물로 마우스를 마취하십시오.</li>
	<li>완전히 마취 될 때까지 마우스를 케이지 안에 다시 넣으십시오. 마우스가 완전히 의식을 잃기까지 약 4-5 분이 걸립니다. 꼬리 또는 발가락을 포셉으로 집어 넣어 마우스가 완전히 의식이없고 수술 준비가되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>마우스를 종이 타월에 등을 대고 눕히십시오. 모발 성장의 반대 방향에 따라 전기 헤어 클리퍼를 사용하여 측면 복부의 머리카락을 제거하십시오. 수술 부위를 면도 한 후 요오드 (또는 클로르헥시딘)를 함유 한 수술 용 스크럽으로 부위를 닦은 다음 70 % 에탄올 (또는 멸균 식염수)으로 헹구십시오.  3 번 반복하십시오. 참고 : 제모 절차는 수술 절차 중 모발 간섭 및 모발 오염을 피하기 위해 수술 절차 벤치와 다른 벤치에서 어느 정도 거리 또는 바람직하게는 수행해야합니다.</li>
	<li>가열 패드를 멸균 시트로 덮으십시오. 마우스를 수술 벤치로 가져 와서 멸균 시트에 올려 놓고 마우스의 오른쪽 측면을 현미경쪽으로 향하게하십시오. 순환수로 패드 온도를 37°C로 일정하게 유지하십시오.</li>
	<li>모든 수술 장비가 들어있는 멸균 된 가방을 엽니 다. 해부 현미경과 멸균 된 날카로운 가위를 사용하여 작은 측면 절개 (13번째 흉부 갈비뼈, 마우스의 마지막 갈비뼈에 가까운)를 만들고 척추에서 약 0.5cm 떨어진 곳에 만듭니다. 요추를 따라 진행하고 1 인치 절개를하십시오.</li>
	<li>피부와 근육을 뒤로 당겨 신장을 노출시킵니다.</li>
	<li>멸균 면봉을 사용하여 주변 지방을 청소하고 제거하여 신장 동맥을 분리하십시오. 구부러진 포셉을 사용하여 신장 동맥에서 신장 신경을 분리하십시오.</li>
	<li>가짜 수술을 수행 할 때 봉합사를 적용하여 피부를 닫고 닫힌 상처에 항생제를 바르고 수술 후 치료를 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 다음 섹션을 진행하여 동맥을 스테노스하십시오. 참고 : 모든 실험에는 수술 절차의 통제로 가짜 동물이 있어야합니다. 샴 동물은 커프를 올려 놓지 않고 신장 동맥을 노출시키는 외과 적 절차를 거친 마우스로 구성됩니다.</li>
</ol>2. 우측 신장 동맥 협착증
<ol><li>오른쪽 신장 동맥 아래에 두 개의 나일론 봉합사를 놓고 느슨한 매듭을 만든 다음 신장과 대동맥 분기 사이의 약 등거리에있는 주요 신장 동맥 주위에 커프를 놓습니다.</li>
	<li>나일론 봉합사를 사용하여 커프를 닫습니다. 수술 후 봉합사가 손실 될 가능성을 피하기 위해 각 봉합사에 대해 네 개의 매듭을 만드십시오.</li>
	<li>간단한 연속 봉합사를 적용하여 근육의 절개를 닫습니다.</li>
	<li>피부를 닫기 위해 간단한 중단 봉합사를 만드십시오.</li>
	<li>IACUC 승인 진통제를 관리하십시오. 참고 : 모든 사용 전에 Autoclave 수술 도구. 한 번에 두 개 이상의 수술을 수행하는 경우 멸균 알코올 게이지로 사용 된 모든 도구를 닦아 모든 수술 후 15-30 초 동안 뜨거운 발아기에 두십시오. 각 마우스에 대해서도 멸균 장갑을 교체하십시오.</li>
</ol>3. 수술 후 치료
<ol><li>생쥐를 새장으로 돌려 놓고 케이지를 반쯤 켜고, 반쯤 떼어 내고, 순환수 가열 패드를 2 - 3 시간 동안 두십시오. 케이지 안에 젤 다이어트 회복 음식을 추가하십시오.</li>
	<li>다음날 진통제(케토프로펜)를 복강내 투여(용량: 5mg/kg BW)한다.</li>
	<li>다음 이틀 동안 마우스의 무게를 재는 단계; 일부 마우스가 체중의 20 % 이상을 잃은 경우 수의사와상의하고 적절한 IACUC 승인 절차에 따라 동물을 안락사시켜야하는지 결정하십시오.</li>
	<li>매일 마우스를 모니터링하여 발적, 붓기, 통증 또는 감염을 평가하십시오.</li>
	<li>제도적 IACUC 정책에 따라 수술 후 합병증에 대한 수의학 상담을 받으십시오.</li>
</ol>4. 조직 수확
<ol><li>수술 후 3 주 후에 조직을 수확하십시오. 각 마우스의 무게를 기록합니다.</li>
	<li>IACUC가 승인한 절차로 마우스를 안락사시킨다.</li>
	<li>마우스를 수핀 위치의 멸균 플랫폼에 올려 놓고 해부하십시오.</li>
	<li>움직임을 제한하기 위해 팔다리를 고정하고 확장하십시오.</li>
	<li>마우스에 70 % 에탄올을 철저히 뿌리십시오.</li>
	<li>날카로운 가위를 사용하여 복부와 가슴 부위를 열기 위해 중간 선 절개를하십시오.</li>
	<li>피부와 복막 벽을 뒤로 당깁니다.</li>
	<li>조심스럽게 심장을 노출시키고 우심실에 구멍을 뚫고 마우스를 exsanguinate하십시오.</li>
	<li>포셉을 사용하여 두 신장을 모두 제거하십시오. 신장은 생쥐의 뒤쪽에 있습니다. 참고: 두 신장을 모두 섞지 마십시오. 협착, 가짜 및 대측성 신장에 유의하십시오.</li>
	<li>신장 캡슐을 제거하고 지방에서 닦아내고 각 신장의 무게를 별도로 기록하십시오.</li>
	<li>양쪽 신장의 종방향 절편을 절단하고, 파라핀 포매를 위해 나중에 처리되도록 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA에 고정시키고, 계내 혼성화 (ISH) 및 면역조직화학(IHC)을 수행한다. 보고된23,24대로 ISH 및 IHC 프로토콜을 따르십시오.</li>
	<li>남아있는 신장의 피질을 분리하고 액체 질소에서 플래시 동결하여 웨스턴 블롯을 수행하십시오. 분석될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관한다.</li>
	<li>레닌을 정량화하고, N-GAL 발현을 문헌23,24에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 정량화한다.</li>
</ol>5. 통계
<ol><li>세 가지 이상의 조건을 가진 실험에는 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용한 다음 개별 그룹 간의 비교를 위해 Bonferroni 사후 테스트를 사용하십시오. p-값이 0.05보다 작거나 같다고 가정하십시오. 소프트웨어(예: GraphPad Prism 8.2)를 사용하여 모든 통계 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

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<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+signaling+pathways+activated+in+a+murine+model+of+two-kidney%2C+one-clip+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of signaling pathways activated in a murine model of two-kidney, one-clip hypertension.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (4), 1055-1068 (2009).</li>
<li>Wiesel, P., Mazzolai, L., Nussberger, J., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-kidney%2C+one+clip+and+one-kidney%2C+one+clip+hypertension+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice.</a> Hypertension. 29 (4), 1025-1030 (1997).</li>
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</ol>

재정적 또는 기타 이해 상충은 저자에 의해 선언되지 않습니다.

신장 동맥 협착증은 이차 또는 내성 고혈압 및 신장 손상 1,29의 중요한 원인이다. 두 개의 신장 1 클립 (2K1C) Goldblatt 모델은 RAStenosis 유도 망막 혈관 고혈압1,17,18,19를 연구하기 위해 채택되었다. 다양한 동물 모델을 사용한 다수의 이전 연구들은 신장 동맥의 협착이 레닌 과발현 및 방출의 강력한 자극제이며, 신장 손상 18,30,31,32,33,34,35임을 보여주었다. 더욱이, 이 모델은 면역 세포 침윤, 섬유증, 염증, 및 급성 및 만성 신장 손상 마커29를 연구하는데 사용된다.
여기에서, 우리는 마우스에서 재현 가능하고 신뢰할 수 있으며 일관된 신장 동맥 협착 모델을 생성하기 위한 상세하고 단계별 절차를 설명했습니다. 이전에는 신장 동맥 협착증36,37,38을 시작하기 위해 금속 클립이 사용되었습니다. 대안으로, 폴리우레탄 원형 튜브(MRE 025; 내경(ID) = 0.30mm, 외경(OD) = 0.63mm, 벽 두께, (WT) = 0.16mm)을 사용했습니다. 우리는 폴리 우레탄 커프를 배치하면 금속 클립과 같이 하나 (평평 화)가 아닌 두 가지 차원 (수축)으로 수축되기 때문에 튜브를 사용했습니다. 또한, 폴리우레탄 원형 튜브를 사용하면 신장 동맥에 균일한 수축의 이점을 제공합니다. 중요한 단계와 과제는 현미경을 사용하여 수행해야하는 세부 사항에 극도의주의가 필요한 폴리 우레탄 튜브의 올바른 크기를 절단하는 것입니다. 또 다른 중요한 기준은 튜브를 신장 동맥에 맞추기 위해 마우스를 18-22g 사이로 유지하는 것입니다. 이러한 체중 범위 내의 마우스는 일반적으로 튜빙 커프 직경의 범위 내에 일관되게 있는 신장 동맥 외경(OD)을 갖는다. 이 방법의 한계는 무거운 (25g 이상) 또는 작은 (16g 미만) 마우스가 튜브와 커프의 크기 때문에 수술을 수행하기가 어렵다는 것입니다. 그러나, 필요할 때, 폴리우레탄 튜빙의 변경은 더 젊거나 더 오래된 마우스를 수용하기 위해 이루어질 수 있다.
우리는 약 95 %의 성공률로 마우스에서 신장 동맥 협착을 시작하기 위해 3 일 및 15 일 연구를 수행했습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때,이 방법을 사용하여 신장 동맥 협착증의 유도는 성별에 관계없이 쥐들 사이에서 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 일관된 결과를 산출했습니다. 신장 동맥의 수축을 확인하기 위해, 우리는 레닌 발현과 신장 손상을 측정했다. 우리의 데이터는 stenosed 신장에서 레닌 발현이 유의하게 증가한다는 것을 시사한다.

신장 동맥 협착증 (RAStenosis)은 65 세 이상의 사람들의 약 6 %와 관상 동맥 또는 말초 혈관 질환 1,2 환자의 최대 40 %에 영향을 미치는 난치성 문제입니다. 질병에 대한 현재 치료법은 제한적입니다. 따라서 RAStenosis에 의해 유발 된 망막 혈관 고혈압 또는 내성 고혈압을 치료하기위한 새로운 치료법을 개발할 필요가 있습니다. 레닌 안지오텐신 알도스테론 시스템(RAAS)은 RAStenosis 유도성 고혈압 또는 망혈관 고혈압 3,4의 발병기전에 관여하는 주요 경로이다. ACE 억제제 또는 안지오텐신 수용체 차단제와 같은 RAAS를 표적으로 하는 알려진 치료법은 고혈압을 완화시키지만, 신부전 및 고칼륨혈 증5,6,7에 대한 면밀한 검사가 필요하다. 레닌은 RAAS에서 속도 제한 단계를 촉매한다; 그것은 안지오텐시노겐을 안지오텐신 I로 변환시킨다. 죽상 동맥 경화증에서 플라크 형성은 레닌 분비를 유도하는 신장 동맥의 협착을 일으켜 망상 혈관 고혈압 및 신장 손상을 초래합니다8. 다수의 연구들이 인간에서 망혈관 고혈압 동안 산화적 스트레스의 증가된 수준을 보고하였으며, 이는 두 개의 신장 1클립(2K1C) 마우스 모델 및 다른 고혈압 동물 모델 2,9,10,11,12,13,14,15,16으로 확증되었다. . RAStenosis 유도 망혈관 고혈압 동안 레닌 발현 조절의 분자 메카니즘은 잘 이해되지 않으며 추가 조사를 보증한다.
RAStenosis를 안정적이고 재현 가능하게 재해석하는 실험 동물 모델은 새로운 치료법의 개발을 위해 레닌 발현 조절의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 2K1C 마우스 모델은 망혈관 고혈압17,18,19,20의 발병기전을 연구하기 위해 잘 확립된 실험 모델이다. 이 모델은 클립 17,20,21을 사용하는 신장 동맥의 수축에 의해 생성되며, 따라서 레닌 발현 및 고혈압 17,19,20,21의 증가를 초래하는 신장 동맥 폐색을 생성한다. 그러나 동물 모델에서 신장 동맥 협착증을 발생시키는 단계별 절차를 설명하는 기술 보고서는 없습니다.
종래의 U자형 실버 클립, 폴리우레탄 튜브 및 기타 클립은 신장 동맥 협착을 유도하기 위해 신장 동맥을 수축시키기 위해 사용되어 왔다. 일부 연구에 따르면 클립의 디자인과 재질은 2K1C 동물 모델로 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 얻는 데 중요합니다. Lorenz et al.에 따르면, 기존의 U-designed silver clips의 사용은 고혈압의 낮은 성공률 (40-60 %)을 유도합니다.21. 클립 디자인으로 인해 신장 동맥은 옆으로 눌러 약간의 수축을 유발하고 신장 동맥에서 빠져 나올 확률이 높아집니다. 실버 가단성과 연성은 클립 폭의 변화를 허용 할 수 있습니다; 따라서 생쥐들 사이에서 다른 고혈압 수준을 유발합니다. 클립상의 이산화은은 혈관주위 염증, 내막 증식 및 조직 과립화를 일으켜 신장 동맥 직경(22)을 변화시킬 수 있다. 종래의 U-design 실버 클립으로 수득된 고혈압 수준의 가변성으로 인해, Warner et al. 및 Lorenz 등은 마우스에서 신장 동맥 협착을 개시하기 위해 라운더-디자인 폴리우레탄 튜빙을 성공적으로 사용하여, 두 개의 신장 하나의 클립 동물 모델20,21의 보다 안정적이고 일관된 유도를 생성하였다.
이 보고서에서는 폴리 우레탄 튜브를 사용하여 신장 동맥을 수축시키는 마우스에서 실험적 RAStenosis를 생성하는 수술 프로토콜을 설명합니다. 폴리 우레탄 라운드 디자인 커프는 마우스에서 협착을 발생시키는보다 재현 가능하고 신뢰할 수 있으며 저렴한 클립입니다. 이 실험 모델의 목표는 신장 동맥 협착 동안 레닌 발현 조절의 분자 및 세포 메커니즘을 연구하고 정의하는 것입니다. 레닌 발현 및 신장 손상 마커인 호중구 젤라틴아제-관련 리포칼린(N-GAL)을 측정함으로써 RAStenosis 마우스 모델의 성공을 확인하였다.

<table><tbody><tr><td>Diet Gel</td><td>Clear H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Diet-Gel 76A</td><td>Surgery recovery diet</td></tr><tr><td>EMC Heated Hard pad</td><td>Hallowell</td><td>000A2788B</td><td>Heating pads were used to keep mice warm</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture</td><td>Ethicon</td><td>2815 G</td><td>8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>GER 5287</td><td>Sterilize surgical tools between surgeries</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>Ketofen</td><td>Painkiller</td></tr><tr><td>Polyurethane</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>MRE-025</td><td>This tube was used to initiate stenosis</td></tr><tr><td>Povidone-iodine antiseptic swabsticks</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td>It was applied after hair removal and surgery on the skin</td></tr><tr><td>Reflex 7 Clip Applier</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>204-1000</td><td>This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off</td></tr><tr><td>Sterile towel drapes</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>It was used as a bedsheet for mice during surgery</td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Medi-First</td><td>22312</td><td></td></tr><tr><td>Water pump</td><td>Stryker</td><td>T/pump Professionals</td><td>Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery</td></tr></tbody></table>

a modified two kidney one clip mouse model of renin regulation in renal artery stenosis

신장 동맥 협착증은 레닌 안지오텐신 알도스테론 시스템 (RAAS)이 과도하게 활성화되는 관상 동맥 또는 말초 혈관 질환 환자에서 흔한 상태입니다. 이러한 맥락에서, RAAS에서 속도 제한 프로테아제인 레닌의 발현 및 방출의 증가를 자극하는 신장 동맥의 협착이 존재한다. 레닌 발현의 결과적인 상승은 신장 손상 및 말단 장기 손상과 자주 관련된 망혈관 고혈압의 알려진 동인이다. 따라서이 상태에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. 신장 동맥 협착증에서 레닌 조절의 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 이해되지 않았으며 추가 조사를 보증합니다. 마우스에서 신장 동맥 협착을 유도하기 위해, 변형된 2개의 신장 1 클립(2K1C) Goldblatt 마우스 모델이 개발되었다. 오른쪽 신장을 야생형 마우스에서 스테노스화하였고, 가짜 조작 마우스를 대조군으로 사용하였다. 신장 동맥 협착 후, 우리는 레닌 발현과 신장 손상을 결정했습니다. 신장을 수확하고 신선한 피질을 사용하여 레닌의 단백질 및 mRNA 발현을 확인했습니다. 이 동물 모델은 재현 가능하며 혈관 고혈압 및 신장 손상에 관련된 병리 생리학 반응, 분자 및 세포 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

신장 동맥 수축은 협착 된 신장에서 레닌 발현을 증가시키고 대측성 신장에서의 발현을 억제합니다. 협착증의 두 신장 1 클립 (2K1C) 또는 Goldblatt 모델은 레닌 발현 증가 및 신장 손상을 유도한다. 이것은 인간에서 일방적 인 신장 동맥 협착증의 가장 대표적인 모델로 인식됩니다.
레닌과 프로레닌(레닌의 전구체)의 발현은 면역블롯팅을 이용하여 측정하였다. 데이터는 대측성 및 가짜 신장에 비해 스테노시드 신장에서 레닌과 프로레닌 발현이 증가했음을 보여주며, 이는 커프가 신장 동맥을 수축시켜 신장 관류의 변화를 일으킨다는 것을 암시한다(그림 1). 레닌 발현의 국소화를 시각화하기 위해, IHC가 수행되었다. IHC는 잘린 신장에서 레닌의 증가된 발현을 나타내는 면역블롯팅 데이터를 확증하였다(도 2). 더욱이, 구심성 세동맥을 따라 모집된 병타글로메랄(JG) 세포는 협착된 신장에서 관찰되었다(도 2). 레닌 mRNA 발현 수준에 대한 효과를 조사하기 위해, ISH를 수행하였다. ISH 데이터는 대측성 및 가짜 신장과 비교할 때 협착 신장에서 레닌 mRNA 및 JG 세포 모집이 증가했음을 시사합니다 (그림 3).
신장 동맥 협착증의 또 다른 특징은 신장 관류, 수퍼 옥사이드 생산 및 고혈압 2,25,26의 변화로 인한 신장 손상 마커의 상향 조절입니다. 호중구 젤라틴화효소-관련 리포칼린(NGAL)은 잘 특성화된 급성 손상 마커이며, 신장 손상27,28 동안 과발현된다. 따라서, 급성 신장 손상 마커 NGAL은 면역블롯팅을 사용하여 측정하였다. 면역 블롯팅 데이터는 N-GAL이 대측성 및 가짜 신장과 비교했을 때 협착 신장에서 고도로 상향 조절되었음을 보여주었습니다 (그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig01.jpg"> 그림 1: 레닌 표현. 신장 동맥 협착증의 15일 및 3일 후, 마우스를 안락사시켰다. 신장을 수확하고, 레닌 발현은 웨스턴 블롯에 의해 결정되었다. (a)는 15일 스테노스화(왼쪽 패널) 및 가짜 마우스(오른쪽 패널)로부터의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다. (b)는 프로레닌(왼쪽 패널) 및 레닌(오른쪽 패널) 단백질 밴드의 치밀측정 분석을 나타낸 것이다. 베타-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (c)는 3-일 스테노스화 (왼쪽 패널) 및 가짜 마우스 (오른쪽 패널)로부터의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다. (d)는 프로레닌(왼쪽 패널) 및 레닌(오른쪽 패널) 단백질 밴드의 밀도측정 분석을 나타낸 것이다. 베타-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 데이터는 양방향 ANOVA로 계산된 SD. P 값± 평균으로 제시되고 Tukey 사후 검정이 뒤따른다. *P<0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, N=3-6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61058/61058fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig02.jpg"> 도 2: 신장 동맥 협착 후 레닌 발현의 시각화 및 국소화를 위한 면역조직화학 분석. 신장은 3-일 신장 동맥 협착증으로부터 마우스를 안락사시킨 후 분리하였다. 전체 신장의 세로 절단으로부터 한 조각을 4% 중성 완충 포르말린 용액으로 고정시키고, 그 후 점진적인 에탄올 시리즈에서 탈수시키고, 파라핀에 포매하였다. 그린 염색은 레닌 단백질 발현을 나타내고; 파란색, 핵. (A) 협착 된 마우스의 협착 신장 (왼쪽), 대측성 신장 (오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. (B) 가짜 마우스로부터의 가짜 신장 (왼쪽) 및 대측성 신장 (오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. 스케일 바 30 미크론. 90X 배율. (C) 협착 마우스로부터의 협착 신장 (왼쪽), 대측성 신장 (오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. (D) 가짜 마우스로부터의 가짜 신장(왼쪽) 및 대측성 신장(오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. 이 이미지들은 주로 피질 부위에서 촬영되었다. 스케일 바 50 μm. 15x 배율. 흰색 점선 원은 사구체의 위치를 나타냅니다. G: 사구체, AfAr: 구심성 동맥, N=4. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61058/61058fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig03.jpg"> 도 3: 신장 동맥 협착 후 레닌 mRNA 발현의 계내 혼성화 분석. 신장 동맥 협착증의 3일 후, 마우스를 안락사시키고, 신장을 분리하고, 4% 중성 완충 포르말린 용액으로 관류-고정시키고, 점진적인 에탄올 시리즈에서 탈수시키고, 파라핀에 포매하였다. 계내 혼성화는 제조자의 지시에 따라 수행되었다. 진한 적색 염색은 레닌 발현을 나타내는 mRNA; 파란색, 핵. (A) . 협착 된 마우스의 협착 신장 (왼쪽) 및 대측성 신장 (오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. (B) . 가짜 마우스의 가짜 신장 (왼쪽) 및 대측 신장 (오른쪽)의 대표적인 현미경 이미지. 스케일 바 50 μm. 흰색 점선 원은 레닌을 표현하는 사구체를 나타냅니다. G: 사구체, AfAr: 구심성 동맥, N=4. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61058/61058fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig04.jpg"> 도 4: 호중구 젤라틴효소-관련 리포칼린 (N-GAL) 발현 후 신장 동맥 협착증. 3일간 신장 동맥 협착 후, 마우스를 안락사시키고 신장을 수확하고, 웨스턴 블롯으로 N-GAL 발현을 측정하였다. (A) 대표적인 웨스턴 블롯 이미지로부터 3일간 스테노스화(왼쪽 패널)와 가짜 마우스(오른쪽 패널). 베타-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) N-GAL 밴드의 치밀성 분석. N-GAL의 단백질 밀도 값은 β액틴으로 정규화하였다. 데이터는 양방향 ANOVA로 계산된 SD. P 값± 평균으로 제시되고 Tukey 사후 검정이 뒤따른다. **P<0.01, ***P< 0.001, N=3-5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61058/61058fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

변형된 2 신장 1 클립(2K1C) Goldblatt 마우스 모델은 폴리우레탄 튜브를 사용하여 신장 동맥 협착을 개시하여 레닌 발현 및 신장 손상의 증가를 유도하여 개발되었다. 여기에서는 재현 가능하고 일관된 2K1C 마우스 모델을 생성하기 위해 커프를 준비하고 신장 동맥 상에 배치하는 자세한 절차를 설명합니다.

신장 동맥 협착증에서 레닌 조절의 수정 된 두 신장 하나의 클립 마우스 모델

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

절연 신장 동맥 폐색에 대한 한깅 - 무게 시스템의 사용

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

연구

의학

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

신장 허혈 재관류 상해 : 상해의 마우스 모델 및 재생

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

일방적 인 신장 허혈 - 재관류 손상의 효과적인 마우스 모델

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

혈액 투석 접근 관련 손 기능 장애의 쥐 모델

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

마우스입니다 관류 신장 기법

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

생물학

A Mouse 5/6th Nephrectomy Model That Induces Experimental Uremic Cardiomyopathy

Chronic kidney disease (CKD) is a great risk factor for cardiovascular disease events and mortality, and progressively develops to the clinical phenotype called "uremic cardiomyopathy". We describe here an experimental CKD mouse model, named 5/6th partial nephrectomy (PNx) with pole ligation, which developed uremic cardiomyopathy at four weeks post-surgery. This PNx model was performed by a two-step surgery. In step-one surgery, both poles of the left kidney were ligated. In step-two surgery, which was performed 7 days after the step-one surgery, the right kidney was removed. For the sham surgery, the same surgery procedures were performed but without pole ligation of the left kidney or removal of the right kidney. The surgical procedures are easier and less time-consuming, compared to other methods. However, the remnant functional renal mass is not as easily controlled as the renal artery ligation. Four weeks after surgery, in comparison with the sham-operated mice, the PNx mice developed impaired renal function, anemia, cardiac hypertrophy, cardiac fibrosis, and decreased heart systolic and diastolic function.

A Mouse 5/6th Nephrectomy Model That Induces Experimental Uremic Cardiomyopathy

This manuscript provides a detailed two-step surgical procedure to perform mouse 5/6th partial nephrectomy (PNx) with pole ligation. Four weeks after surgery, in comparison with sham-operated mice, the PNx mice developed impaired renal function, anemia, cardiac hypertrophy, cardiac fibrosis, and decreased heart systolic and diastolic function.

마우스 5/6일 신 모델 실험 신부전 심근을 유도

Chronic kidney disease (CKD) is a great risk factor for cardiovascular disease events and mortality, and progressively develops to the clinical phenotype ...

<meta charset="utf8"></head><body>신부전 및 관류불량에 대한 쥐의 표준화된 5/6 신절제술

5/6 Nephrectomy Using Sharp Bipolectomy Via Midline Laparotomy in Rats

Chronic kidney disease (CKD) affects over 10% of the global population, amounting to more than 800 million individuals worldwide. The advances in the treatment of CKD have had a significant impact on patient outcomes. While in the past, CKD was often considered a death sentence, with many patients succumbing to the complications of end-stage renal disease, it is now increasingly being managed as a chronic condition with the availability of dialysis and kidney transplantation, as well as new pharmaceutical developments such as SGLT2 inhibitors or nonsteroidal mineralocorticoid receptor antagonists. 
Yet, there continues to be a growing demand for further exploration into the pathophysiological processes and potential therapeutic interventions. Reliable biological models play a crucial role in facilitating this research. Given the multifaceted nature of renal disease, which encompasses not only cell biology but also vascular microanatomy and endocrine signaling, an appropriate model must possess a level of biological complexity that only an animal model can offer, rendering rodents an obvious choice.
This manuscript, therefore, provides an intricate, systematic protocol for surgically reducing renal parenchyma through midline laparotomy and combined total and partial nephrectomy in rats for survival as well as non-survival applications. It emphasizes the critical role of precise surgical techniques in ensuring consistent and reliable outcomes. Prime examples of potential applications for this model include biomolecular and pharmaceutical studies as well as the development of innovative intraoperative imaging modalities, such as hyperspectral imaging, to objectively visualize and differentiate renal malperfusion.

<meta charset="utf8"></head><body>5/6 쥐에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양족 절제술을 사용한 신장 절제술

This manuscript introduces a standardized protocol for a 5/6 nephrectomy by sharp bipolectomy via midline laparotomy in a rat model, aiming to induce a state of renal insufficiency via renal parenchyma reduction with a great degree of methodical precision and low risk of technical error.

5/6 쥐에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양족 절제술을 사용한 신장 절제술

Chronic kidney disease (CKD) affects over 10% of the global population, amounting to more than 800 million individuals worldwide. The advances in the ...

신장 동맥 협착증에서 레닌 조절의 수정 된 두 신장 하나의 클립 마우스 모델

요약

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마우스입니다 관류 신장 기법

마우스 5/6^일 신 모델 실험 신부전 심근을 유도

5/6 쥐에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양족 절제술을 사용한 신장 절제술

5/6 쥐에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양족 절제술을 사용한 신장 절제술