Le séquençage de l’ARNm à cellules simples est largement utilisé pour comprendre les processus biologiques à un seul niveau cellulaire. L’avènement des stratégies de multiplexage a encore élargi ses amplifications en permettant le profilage de plusieurs échantillons en une seule expérience, réduisant considérablement le coût et évitant les effets de lots. Wei Feng, postdoc, et Andrew Przysinda, technicien de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Après compter, diviser les cellules isolées du jour embryonnaire 18,5 chambres cardiaques en cinq fois 10 à la cinquième aliquots et laver les cellules deux fois avec PBS frais par lavage. Resuspendez les granulés dans 180 microlitres de PBS par échantillon et ajoutez 20 microlitres de solution de stock de code à barres d’ancrage à chaque tube avec le mélange doux. Après une incubation de cinq minutes sur la glace, ajouter 20 microlitres de solution de stock de code à barres co-ancre à chaque tube avec mélange doux pour une incubation supplémentaire de cinq minutes sur la glace avant de laver les cellules trois fois avec un millilitre de PBS froid complété par 1% d’albumine de sérum bovine par lavage, puis filtrer les échantillons dans de nouveaux tubes à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres par tube.
Après comptage, assembler la puce B dans un porte-copeaux, puis ajouter 75 microlitres d’une solution glycérol à 50 % aux puits inutilisés dans la première rangée, 40 microlitres aux puits inutilisés dans la deuxième rangée et 280 microlitres aux puits inutilisés de la troisième rangée. Notez qu’une puce de formation est utilisée ici pour démontrer la procédure. Ajoutez le volume approprié de suspension cellulaire et d’eau sans nucléase au mélange principal avec un tuyautage doux.
Ajouter 75 microlitres de la solution cellulaire résultante au centre inférieur de l’échantillon bien dans la première rangée sans bulles. Vortex les perles de gel pendant 30 secondes avant d’ajouter lentement 40 microlitres de perles au centre inférieur de la perle de gel bien dans la rangée deux sans bulles. Ajouter 280 microlitres d’huile de cloisonnement sur la paroi latérale du puits de partitionnement dans la troisième rangée.
Attachez le joint à la puce sans appuyer sur le joint et en gardant le joint horizontal pour éviter de mouiller le joint. Chargez la puce assemblée avec le joint dans le contrôleur de chrome et exécutez le programme de cellule B unique de chrome. Notez que l’écran affiche la formation de chrome pour la puce de formation, mais pour les expériences réelles de l’écran affichera chrome cellule unique B.When le programme a terminé, immédiatement enlever la puce et jeter le joint.
Repliez le couvercle pour exposer les puits à un angle de 45 degrés et vérifiez les niveaux liquides pour vous assurer qu’aucun sabot n’est présent. Aspirez lentement 100 microlitres de perles de gel dans l’émulsion des points les plus bas du puits de récupération et vérifiez l’uniformité des perles. Distribuez les perles émulsionnifiées sur le mur d’un nouveau tube PCR sur la glace et placez le tube dans un cycleur thermique pour transcription inverse.
Pour préparer l’ADNC à l’amplification, ajouter 125 microlitres d’agent de récupération à l’échantillon à température ambiante. Aucun liquide opaque ne doit être observé et éviter le pipetage ou le vortex. Attendez 60 secondes avant d’enlever lentement l’agent de récupération du fond du tube et ajouter 200 microlitres de mélange de nettoyage de perles vortex à l’échantillon.
Pipette le mélange 10 fois avant d’incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, placez les échantillons sur un aimant en position élevée. Lorsque la solution se dégage, retirer le supernatant et ajouter 200 microlitres de 80% d’éthanol à la pastille.
Après 30 secondes, retirer l’éthanol et répéter le lavage deux fois de plus. Après le dernier lavage, centrifugez brièvement l’échantillon et placez le tube sur l’aimant en position basse pour permettre à l’échantillon de sécher à l’air libre pendant moins de deux minutes. Lorsque l’échantillon a séché, retirer le tube de l’aimant et ajouter 35,5 microlitres de solution d’élitution fraîchement préparée.
Après une incubation de deux minutes à température ambiante, placez l’échantillon sur l’aimant en position élevée jusqu’à ce que la solution se dégage avant de transférer 35 microlitres de l’échantillon sur une nouvelle bande de tube. Pour l’amplification cDNA à l’aide de la stratégie de codage à barres à base de lipides, ajouter le mélange de réaction d’amplification aux échantillons de cDNA de 35 microlitres avec un mélange complet avant de centrifugage brièvement. À la fin de la vrille, incuber l’échantillon dans le cycleur thermique suivant la procédure d’amplification appropriée de l’ADND.
Ajouter 120 microlitres de réaccenter sélectionnés et 100 microlitres d’eau ultrapure à 100 microlitres d’échantillon et pipette le 0,6 x réapprovisionnement sélectionné résultant 15 fois. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, placez l’échantillon sur l’aimant jusqu’à ce que la solution devienne claire. Transférez le supernatant dans un tube de liaison bas de 1,5 millilitre pour la construction de la bibliothèque cDNA à code à barres multiplexant.
N’oubliez pas d’enregistrer à la fois les supernatants et la base pendant que le contenu du supernatant assemble le cDNA codé à barres et le contenu de base endogène cDNA. Nettoyez l’ADNC endogène avec 80 % d’éthanol et élitez l’ADN avec 40 microlitres de tampon d’élitution, puis exécutez une vérification de contrôle de la qualité de l’ADNC endogène avant de préparer une bibliothèque de transcription endogène. La concentration de l’ADND doit être quantifiée et qualifiée avant la construction de la bibliothèque.
Les bibliothèques construites, y compris les bibliothèques endogènes d’ADN et de codes à barres, devraient également être quantifiées et qualifiées avant le séquençage. Après séquençage, l’expression du code à barres peut être analysée dans chaque cellule. Par exemple, dans cette analyse, huit groupes de cellules individuelles qui exprimaient de façon unique un type de code à barres représentant des cellules provenant de huit échantillons différents ont été observés.
En outre, certaines cellules n’ont pas exprimé de code à barres et ont donc été définies comme des cellules négatives, tandis que d’autres cellules ont exprimé deux codes à barres différents représentant des doublets. À l’aide des cellules singlet, l’hétérogénéité cellulaire et les règlements moléculaires pourraient être évalués par annotation de type cellulaire, identification de type cellulaire nouveau et rare, analyse comparative de zone anatomique et analyse des voies d’ontologie génétique, telles que les séparations de phase du cycle cellulaire. Il est utile d’imager les perles de gel dans l’émulsion si vous le pouvez, comme une image vous dira si oui ou non la procédure a été couronnée de succès jusqu’à ce point.
Le multiplexage d’échantillons ajoute une grande flexibilité dans la conception de vos expériences. Après avoir regardé cette démonstration, j’espère que vous serez plus confiant s’il s’agit de commencer vos propres expériences.
