우리의 genotyping 프로토콜의 주요 장점은 모계 DNA로 오염을 최소화한다는 것입니다, 이는 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 어유 조직을 genotyping 할 때 주요 도전이다. 유동 세포측정은 수다티디폼 두더지의 진단을 크게 용이하게 하는 빠르고 저렴한 방법입니다. 각 포르말린 고정 파라핀 임베디드 또는 펙핀에 대해, 개념작용의 생성물인 FFPE는 현미경 검사법에 의한 형태학적 평가를 위해 이 비디오에 상세히 설명된 대로 4미크로닌 두께의 헤마톡시린 및 에오신 얼룩 섹션을 준비한다.
단면을 용이하게하기 위해 15 분 동안 얼음에 FFPE 블록을 배치합니다. 미세 항을 조정하여 미세한 형태학적 평가를 위해 4개의 미크론 두께의 단면을 잘라냅니다. 차가운 블록을 마이크로톤에 놓고 H&E 염색을 위해 각 블록에서 한 부분을 잘라냅니다.
집게를 사용하여 각 구간을 섭씨 45도까지 옮기는 다. 이전에 연필을 사용하여 샘플 식별 번호로 표시된 양충전 슬라이드로 수조에서 섹션을 선택하십시오. 섹션이 슬라이드를 부착할 수 있도록 섹션이 포함된 슬라이드를 섭씨 65도에 오븐에 놓습니다.
슬라이드를 오븐에 25분간 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 표로 된 올바른 기간 동안 슬라이드를 적절한 염색 항아리에 잠급하여 H&E 염색을 수행합니다. 마운팅 배지를 가진 형태학적 분석을 위해 4미크로닌 섹션을 장착합니다.
그리고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. H&E 슬라이드와 가벼운 현미경을 사용하여 가장 많은 양의 융모를 사용하는 FFPE 블록을 선택합니다. 그리고 가능하다면, 모성 조직과 섞이지 않고 초리오닉 빌리가 분리되어 있는 블록.
DNA 추출을 위해 두꺼운 10 미크론인 부분을 절단하기 위해 마이크로토메를 조정합니다. 블록의 융모의 양에 따라 10 ~30 섹션을 잘라냅니다. 슬라이드가 있는 섹션을 이전과 같이 픽업한 후 섹션이 65도의 오븐에 있는 슬라이드를 배치하여 섹션이 슬라이드를 부착할 수 있도록 합니다.
슬라이드를 오븐에 20분 간 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 표로 된 올바른 기간 동안 슬라이드를 적절한 염색 항아리에 잠급하여 H&E 염색을 수행합니다. 독성 자일렌 냄새가 사라지기 위해 연기 후드 아래에 슬라이드를 최소 3 시간 동안 둡니다.
집게를 사용하여, 촉촉한 종이 닦아작은 종이 조각을 찢어. 가벼운 스테레오 현미경으로, 포셉과 물 촉촉한 종이 물티슈의 작은 조각을 사용하여 H&E 얼룩 10 미크론 두께의 섹션에서 원치 않는 모든 모성 조직을 긁어 냅니다. 이 단계의 핵심은 인내심, 특히 도전적인 블록에 대한 것입니다.
또한 다른 사람이 모성 조직을 놓치지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이제, 촉촉한 종이 물티슈에서 새 종이를 찢고 그것을 사용하여 융모의 사악한 것을 수집합니다. 1.5ml 튜브에 부착된 융모성 빌리와 종이 물티슈 조각을 놓습니다.
DNA 추출 컬럼을 너무 많이 막히면 수집된 DNA의 최종 양을 줄일 수 있으므로 이 단계에서 사용되는 종이 물티슈의 양을 최소화하십시오. DNA 추출을 수행하기 위해 FFPE 키트에서 DNA 추출 프로토콜을 따르십시오. 실험실 분광계를 사용하여 DNA 1 마이크로리터를 적재하고 216 nm에서 흡수성을 측정하여 정량화를 합니다.
2% 아가로즈 젤에 DNA 1 마이크로리터를 적재하고 질적 평가를 위해 80~100볼트의 전압으로 젤 전기전경을 실행합니다. DNA 평가 결과에 기초하여, 멀티플렉스 짧은 탠덤 반복 PCR 증폭에 사용될 DNA의 부피를 선택한다. DNA의 최소 1000 나노 그램을 사용하는 것을 목표로합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 PCR 증폭, 모세관 전기포고 및 데이터 분석을 진행한다. 이상적인 FFPE 블록을 선택하려면 가벼운 현미경으로 H&E 슬라이드를 사용하여 chorionic villi로 구성된 조직의 약 50~70%가 있는 FFPE 블록을 선택합니다. 이상적인 양의 융모가 없는 블록의 경우 단면이 수행됨에 따라 융모성 빌리를 풍부하게 합니다.
이렇게 하려면, 새로 잘라 섹션의 어느 쪽이 해당 H&E 슬라이드에 따라 더 많은 chorionic villi를 포함 식별합니다. 그런 다음, 융모성 빌리를 위해 풍요롭게하기 위해 버려야 하는 나머지 절반을 잘라내기 위해 블레이드를 사용합니다. 최상의 FFPE 블록의 단면을 수행하려면 마이크로토메를 사용하여 두께가 50미크론인 4개의 섹션을 잘라냅니다.
이상적인 FFPE 블록을 사용할 수없는 경우, 그럼에도 불구하고 모계 조직에 대한 융모 의 비율을 유지하는 것을 목표로. 예를 들어 블록의 30%만이 초리오닉 빌리로 구성되고 나머지는 모성 조직이 있는 반면, 모성 조직이 포함된 섹션의 절반 이상을 제거하고 보상하기 위해 더 많은 섹션을 사용합니다. 섹션은 15mL 튜브에 배치합니다.
분리 및 재수화를 위해 연기 후드에서 작업하여 각 시약을 추가하고 텍스트 프로토콜에 표화된 적절한 기간을 기다립니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫으로 진공 흡입에 의해 시약을 제거합니다. 다음으로 15mL 튜브에 섭씨 4도 구연산 용액을 추가합니다.
섭씨 80도의 수조에 2시간 동안 놓은 후, 실온까지 용액을 식히게 하십시오. 진공 흡입에 의해 구연산용액을 제거합니다. 1x PBS, 소용돌이의 6 밀리리터를 추가하고 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 기다립니다.
필요한 경우 샘플을 1000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 진공 흡입에 의해 1X PBS를 제거합니다. 이제 예열 된 펩신 용액 1 mL을 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도 건조 목욕에 놓습니다.
10분마다 소용돌이. 이 배큐베이션의 마지막 10분 안에 프로피듐 요오드 리보누엘리스 A 용액을 준비한다. 1x PBS, 소용돌이의 또 다른 6mL을 추가하고 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 기다립니다.
다시, 진공 흡입에 의해 1 x PBS를 제거합니다. 프로피듐 요오드 리보누클로스 A 용액의 550 마이크로리터를 추가하고 샘플을 섭씨 37도 건조 목욕에 30분 간 배치합니다. 집게를 사용하여 폴리스티렌 라운드 하단 튜브의 상단 부분에 48 미크로네 여과 메쉬의 5cm x 5cm 조각을 배치하여 유동 세포계와 함께 사용하십시오.
액체를 메쉬를 통해 튜브로 파이프를 입력하여 용액을 필터링합니다. 샘플은 이제 유동 사이토미터에서 실행할 준비가 되었습니다. 그들이 실행할 준비가 될 때까지 호일에 싸여 유지합니다.
마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 세포 측정 및 데이터 분석을 수행합니다. 부분 수다티디폼 두더지의 마이크로위성 지음, 환자와 그녀의 파트너의 DNA와 함께, 환자의 두더지는 삼중 분산되어 있음을 알 수 있습니다. 첫 번째 1 번째 마커는 개념작용의 제품에 있는 2개의 봉우리를 보여줍니다.
첫 번째 피크는 어머니만이이 크기의 피크를 가지고 있기 때문에 어머니에서 유래합니다. 같은 추론에 따라, 두 번째 피크는 그가 같은 동계를 공유하기 때문에 아버지에서 유래. 두 번째 피크가 첫 번째 피크보다 훨씬 높은 방법을 주목, 그 피크에서 동일한 아버지 의 적 색의 아마 두 개의 복용량이 있음을 나타내는.
모성 오염은 두 번째 모계 적색의 위치에 매우 작은 피크를 표시하기 때문에 개념작용의이 제품에서 매우 최소한의. 두 번째 마커는 개념작용의 제품에 있는 3개의 피크를 보여줍니다. 이 봉우리 중 두 개는 아버지에게서, 하나는 어머니에게서 유래했습니다.
세 번째와 네 번째 마커는 첫 번째 마커와 유사하며 아버지로부터 오는 두 개의 악어와 어머니로부터 하나도 보여줍니다. 네 개의 마커는 모두 아버지로부터 유래한 3개의 악어, 2개는 어머니에게서 유래했기 때문에, 이 임신의 산물은 삼중 분산제이고 부분 두더지의 진단을 확인할 수 있습니다. 지노피 결과 해석을 위해 청소 단계에서 가져온 노트에 따라 오염 수준을 인식하는 것이 중요합니다.
경우에 따라 이러한 두 가지 방법에 따라 결론에 도달할 수 없습니다. 이러한 경우, 우리는 진정한 유전자형을 밝히기 위해 FISH와 같은 다른 방법을 사용합니다. 마이크로위성 유전화는 정확한 어금니 진단을 허용하고 수다티디폼 두더지의 다양한 특징과 관련된 유전자형을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열었습니다.
