여기에 설명된 프로토콜은 우리가 생체 내에서 화학 요법의 기능과 대식세포의 행동을 조사 할 수 있습니다. 세포 화학증의 기존 실험 모델의 대부분은 체외 세포 실험에 기초한다. 그러나 시험관 내 실험은 때때로 생체 내복잡한 환경을 모델링하기에는 너무 간단합니다.
또한, 그들은 생체 내에서 화학 능력의 화학을 나타내지 않을 수 있다. 이러한 방법은 마우스가 어려운 직접 세포 행동 관찰을 위해 얼룩말 물고기의 특정 이점을 활용합니다. TGFABP-10A 인터류키인-34 형질전환 구체를 생성하여 시작합니다.
FABP-10A 인터류킨-34를 1개의 세포 단계 Tg(mpeg1:GFP)의 트랜스제닉 및 트랜스포사제 MRNA와 함께 야생형 물고기 배아로 주입한다. 원고 지침에 따라 배아를 올리고 수집합니다. 그런 다음, 4섭씨또는 실온에서 2시간 동안 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드로 수정합니다.
고정 후, 세척 당 5 분 동안 PBST로 세 번 배아를 세척합니다. PBST에서 50%의 메탄올로 배아를 따로 탈수한 다음 100% 메탄올로 변경한 다음 신선한 100% 메탄올로 변경한 다음 최소 2시간 동안 음수 섭씨 20도에 저장합니다. 프로브 혼성화를 위해 준비되면 PBST에서 50 %의 메탄올에서 배아를 별도로 재수화하십시오.
그런 다음, 세척 당 5 분 동안 PBST로 세 번 세척합니다. 실온에서 PBST에서 단백질제 K로 배아를 소화합니다. 그런 다음 소화 용액을 버리고 실온에서 20 분 동안 4 %의 파라 포름 알데히드로 고정을 반복하십시오.
고정 후, 세척 당 10 분 동안 PBST로 배아를 두 번 씻으십하십시오. 가열 된 혼성화 버퍼로 적어도 한 시간 동안 섭씨 65도에서 사전 혼성화를 수행하십시오. 그런 다음 인터류신-34 프로브를 섭씨 65도로 예열하여 10분 동안 예열합니다.
혼성화 버퍼를 원래 튜브로 재활용하고 예열된 프로브를 통해 밤새 섭씨 65도에서 혼성화를 수행합니다. 다음 날, 50%의 포르마이드와 2X SSCT로 배아를 씻고 2배 SSCT, 섭씨 65도에서 0.2X SSCT로 뒤를 잇는다. 세차당 20분씩 세 번 씻는 다.
그런 다음, 세척 당 5 분 동안 PBST로 배아를 세 번 씻는다. 실온에서 1시간 동안 600밀리리터의 블로킹 버퍼로 샘플을 차단합니다. 그런 다음, 항 디곡시겐 HRP 항체 용액의 400 마이크로 리터를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배아를 배양합니다.
다음 날, 항체를 제거하고 세척 당 20 분 동안 PBST로 6 번 배아를 세척하십시오. 마지막 세척 후 각 샘플을 1X 30 마이크로리터와 5분간 증폭 희석제로 헹구는 다. 어둠 속에서 5~15분 동안 플루오로포레 티라민 작업 용액의 샘플을 배양합니다.
신호가 약한 경우 인큐베이션 시간을 30분으로 연장합니다. 그런 다음, 세척 당 10 분 동안 PBST로 세 번 배아를 씻는다. 그리고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차 항체로 배양하십시오.
다음 날, PBST로 배아를 세척 당 30 분 동안 5 번 씻고 하룻밤 사이에 4도에서 이차 항체로 배양하십시오. 다음 날, PBST에서 세 번 배아를 세척 당 10 분 동안 씻고, 4 섭씨 또는 음의 20도에서 어둠 속에서 70 %의 글리세롤에 보관하십시오. 이미징에 앞서, 형광 현미경을 사용하여 DS 적색 및 GFP 이중 양성 배아를 선택합니다.
물고기를 장착하려면 금속 목욕을 사용하여 1 % 낮은 녹는 아가로즈1 밀리리터를 섭씨 90도 이상으로 가열하십시오. 그런 다음 체온으로 식히고 0.2 % 트리카인의 50 마이크로 리터에 섞습니다. 마취된 배아를 바닥에 덮개 슬라이드가 장착된 작은 접시에 옮기.
주변 물을 제거하고 천천히 배아에 낮은 녹는 아가로즈를 떨어 뜨립니다. 아가로즈가 고화되기 전에 물고기의 위치를 신중하게 설정하여 간 부위를 덮개 슬라이드에 가깝게 유지합니다. 아가로즈가 굳어지면, 그것을 강화하기 위해 아가로즈의 또 다른 층으로 조심스럽게 덮어주세요.
공초점 현미경 캐리어 테이블에 접시를 놓고, 트리카인으로 E2 용액으로 물고기를 덮고, 이미징을 시작합니다. 공초점 현미경을 작동하려면 Zen Black 2.3 소프트웨어를 열고 위치를 클릭한 다음 인큐베이션을 클릭한 다음 온도를 섭씨 29도로 설정합니다. 획득 메뉴를 클릭하고 스마트 설정 메뉴에서 필요한 스캔 모드와 레이저를 선택합니다.
그런 다음 Z 스택 및 위치를 선택합니다. 실험 디자이너 메뉴를 클릭하고 낮은 배율에서 샘플을 찾기 위해 첫 번째 블록에서 멀티 블록 실험을 활성화 선택합니다. 그런 다음, 높은 배율로 전환하고 시야의 중심에 관찰 된 영역을 보자.
위치 및 Z 스택 정보를 설정합니다. 그런 다음 적절한 레이저 강도, 스캐닝 레이어 및 이미징 속도를 선택합니다. 모든 블록을 설정하면 적절한 루프 수를 설정하고 레코딩을 시작합니다.
이 프로토콜은 간 특정 인터류킨-34 발현 플라스미드를 형질식 물고기 배아로 주입하는 데 사용되었으며, 대식세포는 GFP로 표시되었다. 시상 혼성화 및 면역염색내의 풀 마운트 형광은 인터류빈-34 및 GFP 표지 된 대식세포의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 대식세포 수는 주입되지 않은 배아의 간 및 꼬리 부위를 주입하여 정량적으로 분석되었다.
라이브 이미징은 대식세포, 녹색으로 표시되어 대조어의 간을 통과하고 물고기를 표현하는 동안 인터류킨-34의 간으로 이동하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 관심있는 셀에 레이블을 지정하는 적합한 형질 전환선의 선택을 포함한다. 그리고 적절한 관측 시간 창뿐만 아니라 형질 전환 유전자의 발현을 이미징하기위한 적절한 조직.
이 기술은 생체 내T 세포 및 호중구와 같은 다른 세포의 행동에 대한 다른 chemokines의 기능을 연구하기 위해 적용 될 수있다.
