단일 클론 항체는 바이오 의약품 시장을 지배하고 전형적으로 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 에 따른 수지는 항체 기반 치료제의 가격에 영향을 미치는 생산 중 주요 비용 동인이다. 여기서 우리는 HIV 중화 항체 2F5의 선형 에피토프를 위한 담체로서 읽히는 형광 단백질을 기반으로 하는 새로운 친화성 리간드를 설명한다.
일반적으로 우리의 방법은 단일 클론 항체의 캡처에 사용할 수있는 친화성 크로마토그래피 수지의 빠른 생성을 허용합니다. 우리는 원유 식물 추출물에서 항체 2F5를 포착하여 이러한 능력을 입증했습니다. 동적 바인딩 용량과 수지 재사용성을 개선하기 위해 캡처 조건및 솔루션 버퍼를 최적화했습니다.
우리의 수지 단백질 A 보다 일반적으로 느슨한 조건을 허용 하 고 단일 클 론 항체의 정화 비용을 줄일 수 있는 잠재력을 가지고. 더욱이, 수지는 선형 에피토프에 결합하는 그밖 항체에 쉽게 적응될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 실험의 설계에 의해 정의된 대로 리터당 5~15그램의 범위에 있도록 준비된 친화성 리간드 용액의 농도를 조정한다.
결합 반응이 준비될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, DFE 용액으로 두 밀리리터 주사기를 채웁니다. 그리고 1 밀리리터의 침대 부피와 NHS 활성화 크로스 링크 아가로즈 컬럼에 주사기를 장착하는 어댑터를 준비합니다.
커플링에 사용되는 10개의 컬럼마다 30밀리리터의 비활성화 솔루션, 30밀리리터의 낮은 pH 솔루션, 1밀리리터의 스토리지 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 튜브에 1 밀리머 염산의 20 밀리리터를 준비합니다. 그리고 적어도 20 분 동안 얼음에 배양.
결합 반응 중에 모든 단계에 대해 분획을 통해 흐름을 모니터링하는 정밀 스케일을 준비합니다. 이 후 밀봉된 NHS 활성화 된 교차 연결된 아가로즈 열을 엽니 다. 공기가 열에 유입되는 것을 방지하기 위해 어댑터 입구에 버퍼 한 방울을 적용합니다.
기둥 입구에 주사기 어댑터를 장착합니다. 차가운 1 밀리머 염산의 6 밀리리터로 컬럼을 씻어, 분당 1 밀리리터보다 적은 유량으로. 2 밀리 리터 주사기를 사용 하 여 즉시 분 당 1 밀리 리터 미만유량에 DFE 솔루션의 1.5 밀리 리터를 주입.
그리고 후속 분석을 위해 정밀 척도에서 분획을 통해 흐름을 수집합니다. 양쪽 끝에서 열을 밀봉하고 섭씨 22도에서 15~45분 동안 배양합니다. 다음으로 활성화 용액의 6 밀리리터를 주입하고, 분당 1밀리리터 미만의 유량으로 6밀리리터의 낮은 pH 용액을 제거하고 수지에서 비공유 결합 리간드를 제거합니다.
활성화 용액의 6 밀리리터를 주입하고 15분 동안 컬럼을 배양합니다. 이 후, 열에 낮은 pH 용액의 6 밀리리터를 주입. 그 다음으로 활성화 솔루션의 6밀리리터가 그 뒤를 잇습니다.
그런 다음 낮은 pH 용액의 또 다른 6 밀리리터를 열에 주입합니다. 2 밀리리터의 저장 솔루션을 열에 주입하고 섭씨 4도에 저장합니다. 먼저 2F5를 함유하는 정제된 식물 추출물 또는 2F5를 포함하는 바람직한 세포 기반 발현 시스템에 대한 상퍼를 100밀리리터를 준비한다.
다음으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 평형 버퍼및 고철 X 강도 환상 버퍼를 준비합니다. 버퍼로 크로마토그래피 시스템을 플러시합니다. 크로마토그래피 시스템에 DFE 선호도 컬럼을 마운트합니다.
그리고 분당 1 밀리리터의 유량으로 평형 버퍼의 5 CV와 평형. 280 나노미터에서 UV 흡광도를 모니터링합니다. 그런 다음 정제된 식물 추출물 또는 1분당 5밀리리터의 유량으로 기둥에 상수체를 80밀리리터로 적재합니다.
2분의 접점 시간을 보장합니다. 두 밀리리터 분획 또는 획기적인 곡선 재구성으로 샘플을 통해 흐름을 수집합니다. 즉각적인 샘플 분석이 불가능한 경우 샘플을 통해 4도에서 흐름을 저장합니다.
이 후 평형 버퍼의 6CV로 열을 세척합니다. 세척의 시작, 중간 및 끝에 샘플을 수집합니다. 5권의 고이온 강도 환상 버퍼로 MAB2F5를 희석시다.
280 나노미터의 UV 신호가 기준선 위의 5밀리 광흡수장치로 증가했을 때 DFE 분획을 수집한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 에피토프 항체 쌍에 대한 환상 버퍼를 최적화합니다. 융합 단백질 DFE는 온실에서 자란 형질전환 담배 식물에서 발현된다.
DFE의 전반적인 복구는 킬로그램 당 23.5 밀리 그램. 90% 이상의 순도와 함께 수지에 고정된 DFE의 절대 양은 열에 주입된 DFE질량과 함께 증가하고, 고원은 리터당 약 15그램으로 증가하지만, 더 많은 DFE가 주입됨에 따라 결합 수율은 지속적으로 감소합니다. DFE 분자는 커플링 후에도 붉은 꽃집을 유지하는 것으로 보입니다.
색상 강도는 고정된 DFE의 총 양에 해당합니다. 따라서 컬럼 색상은 커플링 효율 및 컬럼 품질을 추정하기 위해 간단한 품질 관리 매개 변수로 사용할 수 있습니다. 재조합 2F5 항체는 니코티아나 벤타미안 식물에서 식물성에서 자란 과도하게 생산된다.
원유 식물 추출물에서 2F5를 포획한 후 친화성 컬럼을 사용하여 약 7밀리그램의 정제된 DFE를 사용하여 테스트됩니다. 염화물 농도가 1.25인 경우 DFE 친화성 수지로부터 2F5를 100%에 가까운 회복과 단백질 A 수지와 비교할 수 있는 약 97%의 순도로 충분하다. DFE 선호도 수지의 DBC는 10%2F5 돌파구로, 25사이클 동안 선형적으로 감소하여 초기 가치의 약 15%로 감소합니다.
우리는 우리의 친화성 리간드의 결합 용량을 최적화하기 위해 실험 접근 방식의 디자인을 사용했다. 이러한 조건은 미래에 다른 리간드에 대해 미세 조정할 수 있습니다. 우리의 방법은 제품 특정 리간드에 대한 서브 캐리어 단백질을 스레드에 꽃 단백질을 사용합니다.
동시에 동원 절차의 시각적 품질 표시기로 함수를 추가하여 작업자에게 즉각적이고 직관적인 피드백을 제공합니다.
