נוגדנים חד שבטיים שולטים בשוק הביופארמה ומטוהרים בדרך כלל על ידי כרומטוגרפיה של Protein A. על פי שרפין הוא נהג עלות מרכזי במהלך הייצור המשפיעים על המחיר של טיפולים מבוססי נוגדנים. כאן אנו מתארים ליגנד זיקה חדש המבוסס על חלבון פלואורסצנטי שנקרא כנשא עבור האפיטופ ליניארי של HIV נטרול נוגדן 2F5.
באופן כללי השיטה שלנו מאפשרת את הדור המהיר של שרפי כרומטוגרפיה זיקה אשר ניתן להשתמש בהם ללכידת נוגדנים חד שבטיים. הדגמנו יכולת זו על ידי לכידת נוגדן 2F5 מתמצית צמחים גולמיים. יטבנו את תנאי הלכידה ואת מאגר התניות כדי לשפר את קיבולת הכריכה הדינמית ואת יכולת השימוש מחדש של האם.
שרף שלנו מאפשר בדרך כלל תנאים רופפים יותר מאשר חלבון A ויש לו פוטנציאל להפחית את עלויות הטיהור של נוגדנים חד שבטיים. יתר על כן, ניתן להתאים את האשף בקלות לנוגדנים אחרים שנקשרים לאפיטופים ליניאריים. כדי להתחיל בהליך זה, להתאים את הריכוז של פתרון ליגנד זיקה מוכן, כך שהוא בטווח של 5 עד 15 גרם לליטר כפי שהוגדר על ידי תכנון הניסויים.
אחסן את הפתרון בקרח עד שתגובת הצימוד תהיה מוכנה. לאחר מכן, מלא מזרק אחד של שני מיליליטר בפתרון DFE. ולהכין מתאם כדי לטעון את המזרקים על עמודי אגרוז מופעל NHS עם נפח המיטה של מיליליטר אחד.
עבור כל 10 עמודות המשמשות לת צימוד, הכן 30 מיליליטר של פתרון השבתה, 30 מיליליטר של פתרון pH נמוך, ופתרון אחסון של מיליליטר אחד. ואז להכין 20 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת בצינור. ולהחגירה אותו על קרח לפחות 20 דקות.
הכן קנה מידה מדויק כדי לפקח על הזרימה דרך שברים עבור כל השלבים במהלך תגובת הצימוד. לאחר מכן, פתחו עמוד אגרוז אטום המופעל על ידי NHS. החל טיפת מאגר על כניסת המתאם, כדי למנוע כניסת אוויר לעמודה.
תן את מתאם המזרק בהיכנס העמודה. לשטוף את העמוד עם שישה מיליליטר של קרח קר חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת, בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה. באמצעות מזרק שני מיליליטר, מיד להזריק 1.5 מיליליטר של פתרון DFE בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה.
ולאסוף את הזרימה דרך שבר בסולם דיוק לניתוח הבא. אוטמים את העמוד בשני הקצוות ו דגירה במשך 15 עד 45 דקות, ב 22 מעלות צלזיוס. הבא להזריק שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה, ואחריו שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך, בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה, להסיר ליגנדים שאינם קשורים באופן קווולנטי מן השף.
להזריק שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה, ולהחדיר את העמודה במשך 15 דקות. לאחר מכן, להזריק שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך לתוך העמודה. ואחריו שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה.
ואז להזריק עוד שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך לתוך העמודה. להזריק שני מיליליטר של פתרון אחסון לתוך העמוד, ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. ראשית להכין 100 מיליליטר של תמצית הצמח המובהר המכיל 2F5, או supernatant עבור מערכת ביטוי מבוסס תא המועדף, אשר מכיל גם 2F5.
לאחר מכן הכינו את מאגר האקוויוויליגציה ואת מאגר האשליות בעל חוזק X מברזל גבוה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. רוקן את מערכת הכרומטוגרפיה עם המאגרים. תן עמודת זיקה ל- DFE במערכת הכרומטוגרפיה.
ולהאזין עם חמישה קורות חיים של חיץ שיווי משקל, בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לפקח על ספיגת UV ב 280 ננומטר. לאחר מכן לטעון 80 מיליליטר של תמצית הצמח הבהיר, או על טבעי על העמוד בקצב זרימה של 5 מיליליטר לדקה.
כדי להבטיח זמן יצירת קשר של שתי דקות. לאסוף את הזרימה דרך דגימות בשני שברים מיליליטר או שחזור עקומה פריצת דרך. לאחסן את הזרימה דרך דגימות בארבע מעלות צלזיוס, אם ניתוח מדגם מיידי אינו אפשרי.
לאחר מכן לשטוף את העמודה עם 6CV של מאגר שיווי משקל. לאסוף מדגם בתחילת, באמצע ובסוף לשטוף. לדלל את MAB2F5 עם חמישה כרכים של חיץ אשליה חוזק יוני גבוה.
לאסוף את שבר DFE כאשר אות UV ב 280 ננומטר גדל לחמש יחידות ספיגה מילי מעל קו הבסיס. מטב את מאגר האשליות עבור כל זוג נוגדני אפיטופ, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חלבון ההיתוך DFE מתבטא בצמחי טבק מהו מהודרים, הגדלים בחממה.
ההתאוששות הכוללת של DFE היא 23.5 מיליגרם לקילוגרם. עם טוהר של מעל 90%הכמות המוחלטת של DFE משותק על בשרף עולה עם המסה של DFE מוזרק לתוך העמודה, ומישורים בסביבות 15 גרם לליטר, ואילו התשואה צימוד יורדת ברציפות כמו DFE יותר מוזרק. מולקולות DFE נראים כדי לשמור על florescence האדום שלהם, גם לאחר צימוד.
עוצמת הצבע תואמת לכמות הכוללת של DFE משותק. לכן צבע העמודה יכול לשמש כמטר בקרת איכות פשוט כדי להעריך את יעילות הצימוד ואת איכות העמודה. נוגדן 2F5 רקומביננטי מיוצר באופן חולף בצמחי Nicotiana benthamiana הגדלים בפיטוטרון.
לכידת 2F5 מתמצית הצמח הגולמי, נבדק באמצעות עמודות זיקה, יחד עם כ 7 מיליגרם של DFE מטוהרים. ריכוז מגנזיום כלוריד של 1.25 טוחנת מספיק כדי לחמק 2F5 מן שרפי הזיקה DFE עם התאוששות קרוב 100%ו טוהר של כ 97%אשר דומה שרפי חלבון A. DBC של שרפי זיקה DFE ב 10%2F5 פריצת דרך, יורד באופן ליניארי במהלך 25 מחזורים, על כ 15% מהערך הראשוני.
השתמשנו בגישה של ניסויים כדי לייעל את יכולת הצימוד של ליגנד הזיקה שלנו. תנאים אלה יכולים להיות מכוונים היטב עבור ליגנדים אחרים בעתיד. השיטה שלנו משתמשת בחלבון פלורסנט כדי להשחיל חלבון נושא משנה עבור ליגנד ספציפי למוצר.
יחד עם זאת פשוט להוסיף פונקציות כאינדיקטור איכות חזותית של הליך הגיוס, מתן משוב מיידי ואינטואיטיבי למפעיל.
