우리가이 방법으로 해결 하려는 주요 질문은 어떻게 우리가 생물 공학적으로 관련 된 유전자의 복제에 대 한 지역 식품 시장에서 구입 한 재료에서 RNA 샘플을 사용할 수 있습니다? 여기에서는 태평양 굴을 이 접근 방식과 추가 적용 가능성을 입증하기 위한 사례 연구로 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 굴 샘플의 기존의 게놈 또는 cDNA 염기서열분석이 우회될 수 있다는 것입니다.
대신, 시토크롬 c 산화효소 서브유닛 I 및 NADH 탈수소효소의 서열은 태평양 굴에서 공개적으로 이용 가능한 기준 서열과 비교하여 가장 밀접한 관련이 있는 시편을 선택했다. 이 시편으로부터 제조된 cDNA는 공공 서열 정보를 사용하여 선택될 수 있는 생명공학적으로 관련된 유전자의 복제에 직접 사용될 수 있다. 이 절차를 시연하는 것은 난징농업대학의 글리코믹스 및 글리칸 생명공학 연구센터졸업생 2명이 이용메이 류와 유콴 리(Yuquan Li)입니다.
굴 조직 샘플을 준비하려면 멸균 된 메스를 사용하여 각 굴 표본의 대략적인 기하학적 중심에서 약 100 밀리그램의 균일 한 연조직을 잘라냅니다. 샘플을 액체 질소 50밀리리터로 채워진 박격포로 옮는다. 플래시 냉동 굴 조직을 미세 한 분말로 갈아 넣습니다.
각 시편의 냉동 조직의 75밀리그램을 멸균 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고, 구니디늄 티오야네이트 페놀 추출 시약 1밀리리터와 섞는다. 이 절차의 가장 중요한 단계는 RNA 추출 단계입니다. RNA 분해를 최소화하기 위해서는 굴 조직과 RNA 추출 을 수확하는 사이의 시간을 줄이는 것이 필수적입니다.
원심 분리는 14, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기고, 클로로폼 200마이크로리터를 추가하고, 혼합물이 유백색으로 변할 때까지 10~15초 동안 소용돌이 믹서에 철저히 섞습니다. 다음으로, 원심분리기는 이전과 마찬가지로 15분 동안.
200 마이크로리터 파이펫을 사용하면 상수 층을 방해하지 않고 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 조심스럽게 전달합니다. 원심분리기 튜브에 이소프로필 알코올 500마이크로리터를 넣고 부드럽게 반전하여 샘플을 섞습니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 20 분 동안 둡니다.
원심분리기는 14, 000배, 섭씨 4도에서 8분간, 상수분리기를 제거합니다. 펠릿을 75%에탄올1밀리리터로 재차, 원심분리기는 14, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 재차한다. 모든 상체를 제거하고 에탄올로 세척을 반복합니다.
실온에서 6분간 펠릿을 건조시다. 그런 다음, 말린 RNA 펠릿을 DEPC 처리 된 물의 25 마이크로 리터에 녹여 서 튜브를 얼음에 유지합니다. 24시간 이내에 RNA 샘플을 사용하십시오.
cDNA 라이브러리를 생성하기 위해 먼저 원고에 따라 솔루션을 추가하여 300 마이크로리터 PCR 튜브에서 각 RNA 샘플에 대한 반응 혼합물을 준비한다. 추출된 RNA 샘플의 마이크로리터 1개를 튜브에 추가합니다. PCR 열순환기에서 섭씨 42도에서 60분 동안 혼합물을 배양한 다음 온도를 섭씨 95도로 5분간 증가시면 됩니다.
생성된 cDNA 라이브러리를 섭씨 영하 20도에서 최대 12개월 동안 보관하십시오. 먼저, 생성된 cDNA 라이브러리의 마이크로리터 1개를 원고에 따라 제조된 PCR 혼합물을 포함하는 튜브에 추가한다. PCR 튜브를 PCR 써모사이클러에 넣고, 원고에 따른 어닐링 단계, 신장 단계 및 변성 단계로 구성된 초기 내포화 단계 및 35PCR 반응 사이클로 PCR 증폭을 수행한다.
사이클 후 5분 동안 하나의 마무리 신장 단계를 수행합니다. PCR 제품의 5개의 마이크로리터를 사용하여 아가로즈 젤 전기포광에 의한 품질을 확인합니다. 증폭된 COX1 또는 ND 유전자를 각각 759 또는 748염기 쌍에서 단일 대역으로 관찰한다.
PCR 제품의 나머지 부분을 정화하려면 각 샘플에 고농도의 차오트로픽 염을 함유한 DNA 결합 버퍼 100마이크로리터를 추가합니다. 내용내용을 짧게 혼합하는 소용돌이. 정화 열을 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다.
반응 혼합물을 기둥에 파이펫합니다. 내장 기둥이 있는 튜브를 실온에서 1분 동안 14, 000배 g의 원심분리기에 놓습니다. 2밀리리터 원심분리기 튜브에서 여과물을 폐기한 후, 14, 000배 g에서 원심분리로 700 및 400 마이크로리터의 세척용 액수 W2로 두 번 세척합니다.
다음으로, 금속 블록 히터에서 1 밀리리터의 탈이온된 물을 섭씨 65도로 가열합니다. 컬럼을 새로운 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 예열된 분수의 파이펫 25 마이크로리터를 백색 기둥 멤브레인의 중심으로 옮킨다. 멤브레인이 실온에서 1 분 동안 담가 두십시오.
그런 다음, 실온에서 1 분 동안 14, 000 배 g에서 컬럼으로 튜브를 원심 분리합니다. 열을 버리고 정제 된 PCR 제품을 섭씨 영하 20도에서 최대 12 개월 동안 보관하십시오. 선택적으로 COX1 또는 ND 역프라이머는 양방향 시퀀싱에도 사용할 수 있습니다.
Sanger 시퀀싱의 경우 관련 COX1 또는 ND 포워드 프라이머를 사용하십시오. 시퀀싱 결과를 검색한 후, NCBI 뉴클레오티드 BLAST 온라인 도구를 사용하여 태평양 굴 기준 균주의 게놈 서열과 서열을 비교한다. MgUGD 및 MgUXS 유전자의 각각 전방 및 역 프라이머를 사용하여 이전에 수행했던 PCR에 의해 증폭되고 정화합니다.
소화 완충제로 정제된 PCR 제품을 배양한 후, 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에서 500나노그램의 pET-30a를 용해하여 예치된 pET-30a 벡터를 준비하고, 최대 16마이크로리터를 얹기 위해 탈이온수를 첨가한다. 그런 다음, 10배 농축 소화 버퍼 2개와 20단위 제한 엔토뉴리스 Nde1 및 Xho1 각각 1개의 마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 3시간 동안 37°C에서 혼합물을 배양합니다.
그 후, 1 단위 알칼리 인산염의 마이크로 리터 를 추가하고 추가 시간 동안 섭씨 37도에서 배양. 그런 다음, 알칼리성 인스파타제를 비활성화하기 위해 10분 동안 예열된 금속 블록 히터에 튜브를 10분간 놓습니다. MgUGD 및 MgUXS 유전자를 가진 E.coli BL21 세포를 재배한 후, 2리터 흔들리는 플라스크에서 400 밀리리터 LB 배지로 배양을 옮기고, 섭씨 37도의 온도에서 200 rpm의 셰이커에 놓습니다.
3시간 후, 600나노미터의 파장에서 광미터의 광학 밀도를 확인하고 약 0.5의 흡수에 도달하도록 한다. 그런 다음 셰이커 온도를 섭씨 20도로 줄입니다. 1-어금니 IPTG의 400 마이크로리터를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 3시간 동안 유도합니다.
세포를 수확 한 후 섭씨 4도에서 20 분 동안 초음파 처리로 세포를 방해하십시오. 원심분리기는 14, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안, 활동 테스트를 위한 새로운 튜브에서 상퍼를 수집한다. 활동 분석 후, MgUXS 및 MgUGD 혼합물에 메탄올 20 마이크로리터와 40 마이크로리터의 클로로폼을 첨가하여 반응을 담금질한다.
샘플 혼합물, 원심분리기는 14, 000배 g에서 6분간 4도의 섭씨로 소용돌이합니다. MALDI-TOF 질량 분석법에 대한 새로운 튜브에서 각 튜브의 상부 수성 층을 수집합니다. 본 실험에서, 매우 발산된 시편의 COX1 및 ND 유전자 서열의 서열 정렬은 참조 태평양 굴 균주와 비교하였다.
적색 화살표는 얻어진 cDNA 샘플의 기준 서열과 서열 사이의 뉴클레오티드 차이를 나타낸다. 밀접하게 관련된 굴 시편의 COX1 및 ND 유전자의 서열은 참조 태평양 굴 균주로부터 낮은 발산을 보여줍니다. MALDI-TOF 질량 분석법은 cDNA 라이브러리를 성공적으로 적용하여 산업적으로 관련된 유전자 MgUGD 및 MgUXS를 복제합니다.
젤 이미지는 또한 연속적으로 표현되고 정제된 MgUGD 및 MgUXS의 효소 작용에 의해 생성된 UDP-글루쿠로닉산 및 UDP-xylose를 식별합니다. 이 방법은 참조 서열과 얻은 마커 서열 사이의 완벽한 일치를 필요로하지 않으며 참조되지 않은 굴과 함께 작동하도록 연구원에게 자신감을 주어야한다. 원칙적으로, 이 방법은 밀접하게 관련된 참조 종에서 서열이 공개적으로 이용 가능한 참조되지 않은 생물학적 샘플에 적용될 수 있다.
이 방법은 비 전문가 연구원이 잠재적인 생물학적 중요성의 유전 물질에 쉽게 접근할 수 있게 하고 더 많은 과학자들이 쉽게 접근가능하지만 불완전하게 확인된 생물학적 샘플로 작업할 수 있는 길을 열어줍니다.
