저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 막달레나 Goetz 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 지원에서 CORALINA 방법, 막시밀리안 Wiessbeck 도움이 의견에 대 한 발렌틴 바 우만 개발 하 고 싶습니다. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.

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저자는 공개 없다.

CORALINA는 표적 DNA의 제어 nuclease 소화에 의해 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하 고 결과 이중 좌초 파편의 클로닝을 대량을 사용할 수 있습니다. 통계적 추론을 많은 10 이상7 개별 gRNA 시퀀스는 이미 성공적으로 복제 된 손9에서 프로토콜을 사용 하 여 나타냅니다. CORALINA는 여러 가지 방법으로 사용자 지정할 수 있습니다. 템플릿 DNA의 대상 지역 및 생성 된 라이브러리의 최대한 복잡성을 정의합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, CORALINA 이전 인간에서 생성 된 도서관과 마우스 게놈 DNA9. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 순화 된 BAC DNA에서 CORALINA 라이브러리의 묘사. 추가 사용자 지정 gRNA 식 벡터 및 링커 시퀀스의 선택에 의해 얻을 수 있습니다. 이전 작은 변이 가진 깁슨 어셈블리 링커 길이의 3 개의 다른 쌍 효율9에서 테스트 했습니다.
소화는 대량 DNA에서 그들의 근원, 인 CORALINA gRNAs의 protospacer는 일반적으로 하지 정확히 20 길이, 그러나 쇼는 길이 분포에 따라 달라 집니다 의미와 bp는 절단의 크기 뿐만 아니라 MNase 소화의 매개 변수 페이지 젤에서 만든 s. 대표 예제 그림 2B 와 C, 19 및 27 혈압 사이의 평균 길이 가진 조각 묘사. 우리의 경험에서는, 파편의 길이 생성 된 gRNA protospacer9충실 하 게 유지 됩니다. 20 보다 짧은 조각 동안 혈압 결과 gRNAs의 높은 오프 대상 비율 때문에 피해 야 한다, 더 긴 파편은 그것 이후 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 문제가 훨씬 적은 증명 그 gRNAs와 protospacers 45 만큼 가능성이 혈압은 여전히 기능9.
CORALINA 프로토콜의 2 개의 가장 중요 한 단계는 MNase 소화 조각과 복제 단계의 크기 선택. 너무 짧은 조각의 세대 (예: 평균 18 아래 혈압) 또는 너무 많은 빈 gRNA 식 벡터의 라이브러리를 쓸모 없는 렌더링 것 이다. 따라서, MNase 소화 단계 (그림 2A)을 최적화, 모니터링 절단 (그림 2B, C), gRNA 벡터 등뼈의 완전 한 소화를 위한 확인 하 고 프로토콜을 통해 아무 조각 컨트롤 포함 하는 것이 중요 하다. 특별 한 주의 또한 보존 gRNA 라이브러리의 표현 주의가 있다. 라이브러리 생성에의 한 일반적인 병목은 일반적 확대를 위한 박테리아에 플라스 미드의 효율적인 전송입니다. 따라서, 우수한 역량을 가진 박테리아의 다량 및 많은 수의 개별 electroporation 이벤트는 gRNA 클론의 높은 숫자를 달성 하는 데 필요한.
GRNA 라이브러리 생산을 위한 새로운 전략 다음 년간 CRISPR 기반 심사 접근의 완전 한 잠재력을 수확 하는 데 필요한 것입니다. 심사 모델 시스템 및 다른 CRISPR 기반 엔지니어링 접근의 더 큰 수를 받을 수 있도록 필수 대규모 라이브러리를 생성 하기 위해 비용 효율적인 간단 하 고 사용자 정의 방법에 대 한 상당한 수요가 있다. CORALINA는이 위한 첫 걸음을 제공 하 고 있다. 잠재적인 사용 하는 매니폴드, 게놈의 종합 라이브러리를 생성 하는 특히, cDNA 파생 덜 일반적인 모델 시스템의 라이브러리, 고도로 집중된 라이브러리와는 다른 CRISPR 단백질 (다른 팸에에서 실험적인 체제 요구 사항) 조합에 사용 됩니다.
다른 메서드와 달리 CORALINA 입력 DNA에서에서 모든 가능한 gRNAs를 생성합니다. 그러나, 하나의 방법의 단점은 gRNAs 필요한 팸 시퀀스 부족도 라이브러리, gRNA 라이브러리 세대, CRISPR 식사 (표 1)에 대 한 두 번째 효소 방법으로 공유 하는 기능에에서 포함 됩니다. 이상적인 방법의 선택 gRNA 라이브러리 생성 계획된 심사의 사양에 따라 실험, 특히 자연 (genic, 규제, intergenic) 및 대상 지역 (단일 로커 스, 여러 지역, 게놈 넓은)의 크기. 우리가 볼 때 비 코딩의 많은 CORALINA를 사용 하 여 특별 한 거꾸로 또는 규제 지역 분석, 불완전 한 또는 신뢰할 수 없는 정보 라면 (이국적인 모델 시스템, 종 (예: microbiomes)의 혼합물 또는 실험적 입력 받음), 다른 CRISPR endonucleases 결합 또는 짧고 정의 된 장소 (예: BACs로 표현)에 수행 분석을 흠뻑 젖 게.

분자 타겟팅 도구 세균 CRISPR/Cas9 시스템의 적응 분자 생물학에 있는 가장 최근의 혁명을 발생합니다. 그것은 결코 전에 너무 쉽게 정의 된 genomic 위치에서 chromatin 조작 되었습니다. CRISPR의 일반적인 응용 프로그램에는 타겟된 유전자 돌연변이1, 게놈 엔지니어링2,3, transcriptional 활성화 및 유전자 침묵4편집 epigenome 포함 됩니다. 하나의 특정 CRISPR 시스템의 장점은 응용 프로그램 잘 공부 후보 사이트에 국한 되지 않습니다 gRNA 라이브러리 덜 편향된 스크린을 가능 하 게로. 이러한 사전 실험 지식 없이도 게놈에서 기능 loci의 발견을 촉진 한다. 그러나, gRNA 도서관 건설 현재 주로 기반으로 올리고 뉴클레오티드 종합과 인간의 하지 않은 gRNA 라이브러리를 구매 제한 옵션은 열거나 외부 원본 또는 대상 영역을 마우스 프레임을 읽고. 따라서, 비록 CRISPR 화면이 이미 엄청나게 강력한5,6,7,8, 입증 된 그들의 풍부한 잠재력은 하지 아직 되었습니다 악용.
극복 하기 위해 클래식 gRNA 세대 방법 두 가지 전략의 한계 최근에 개발 되었습니다. 둘 다 사용자 지정 oligonucleotide 합성에 의존 하는 것 보다는 표적 DNA의 효소 소화를 제어 기반으로 합니다. 제한 효소의 사용 CORALINA9 micrococcal nuclease만 현재 사용할 수 있는 다른 방법을 CRISPR 먹고10, 사용 하는 동안 (Hpa2 세, ScrFI, Bfa Mme와 나 나). 중요 한 것은, 두 기술은 어떤 입력된 DNA gRNA protospacer 시퀀스의 소스 역할에 적용할 수 있습니다. CRISPR 먹는 방법 누구의 대상 사이트는 필요한 S.pyogenes 팸 (protospacer 인접 한 동기)에 의해 준수 하지 복제 gRNAs의 수를 줄일 수 있도록 전략 고용, 하는 동안 그것에 대 한 모든 가능한 기능 gRNAs의 극히 일부에 생성 한 지정 된 지역입니다. CORALINA, 다른 한편으로, 소스 시퀀스에 대 한 모든 잠재적인 gRNAs를 생성할 수 하 그러나 또한 비 기능 가이드의 더 높은 부분을 통합 한다. gRNA 라이브러리 생성 제어 nuclease 활동을 통해 어떤 종족에 대 한 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생산 수 있습니다 간단 하 고 비용 효율적인 방식으로 어떤 Cas9 단백질 또는-이펙터 시스템. 또한, CORALINA은 라이브러리 유형, 크기 및 콘텐츠를 정의 하는 적절 한 입력 및 벡터 선택 사용자 지정에. 여기, 상세한 프로토콜을 제시 세균 인공 염색체 (BACs) 또는 genomic DNA9를 포함 하 여 DNA (그림 1)의 다양 한 소스 로부터 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생성에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 동반 하는 대표적인 결과 BAC dna CORALINA 프로토콜을 적용 하 여 파생 되었다.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inactivation of Mnase</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&amp;reg; TBE Gels, 20%, 10 well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td></tr><tr><td>O&#039;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&amp;reg; TBE Running Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE gel running buffer</td></tr><tr><td>Disposable scalpel, sterile</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>233-5363&amp;nbsp;</td><td>2.3., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;br/&gt; S9430</td><td>2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>3M Sodium acetate , pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; R1181</td><td>3.6.4., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td></tr><tr><td>Quick blunting kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>ammomium acetate</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; A1542</td><td>3.1., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>magnesium acetate</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; M5661</td><td>3.1., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>concentrated T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>&amp;nbsp;M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Long Amp Taq 2X Master Mix&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td>&lt;br/&gt; DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>TG1 competent cells</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>1mm gap electroporation cuvettes&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&amp;nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&amp;nbsp;</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653&amp;nbsp;</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>throughout</td></tr><tr><td>Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Biorad</td><td>732-2267&amp;nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>250 ml centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

게놈과 epigenome 엔지니어링에 대 한 CRISPR/Cas9 시스템의 인기는 그것의 간명 및 적응성에서 유래한 다. (Cas9 nuclease 또는 nuclease 죽은 dCas9 융합 단백질)는 이펙터 가이드 RNA, 또는 gRNA로 알려진 작은 합성 RNA 게놈에 있는 특정 사이트에 대상 이다. CRISPR 시스템의이 분 자연 플라스 미드 라이브러리 포함 식 카세트 개별 gRNAs의 수천의 단일 실험에서 많은 다른 사이트가 사용할 수 있습니다 이후 접근 차단에 그것의 사용을 수 있습니다.
날짜 하려면, 라이브러리의 건설에 대 한 gRNA 시퀀스는 oligonucleotide 종합 라이브러리에서 시퀀스의 달성 복잡성을 제한 하 고 상대적으로 비용 많이 사용에 의해 거의 독점적으로 생성 된 것. 여기, CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대)에 대 한 상세한 프로토콜 간단 하 고 매우 복잡 한 gRNA 라이브러리의 생성에 대 한 비용 효율적인 방법을 입력 DNA의 효소 소화에 기반, 설명. DNA의 모든 소스에서 CORALINA 라이브러리를 생성할 수 있습니다, 이후 사용자 지정에 대 한 옵션을 많이 존재, CRISPR 기반 스크린의 큰 다양성을 사용 한다.

가까이는 프로토콜을 사용 하 여, CORALINA gRNA 라이브러리와 마우스 게놈 DNA9 인간과 BAC DNA (그림 1)에서 생성 된 것. GRNA 식 벡터에 클로닝을 위한 적합 한 입력된 DNA의 파편을 생성, 제어 nuclease 소화에 대 한 최적의 조건을 결정 해야 합니다. Micrococcal nuclease 소화의 최적화에 대 한 일반적인 결과 그림 2A에서 묘사 된다. 부족 한 양의 nuclease (0.1, 2, 3, 4, 4.5 또는 5 단위) 생산 필요한 크기 범위 (10-100 bp)에서 눈에 띄는 제품 및 5.5-7.5 단위는 여전히 생산 한다 너무 긴 평균에 있는 조각. 더 많은 양의 효소 (50 단위) 10 분 후 입력 DNA의 과도 한 저하를 발생할. 따라서, 중간 금액 (10 단위)를 선택 했습니다. 다이제스트 충분히 생산 이후 정화 및 (그림 2B) 복제에 대 한 조각 소화 조절 했다. 맹목적으로 크기에 의해 DNA 파편을 선택 하 여 DNA 파편의 자외선에 노출을 최소화 하는 방향에 대 한 DNA 사다리에만 의존 하는 것이 좋습니다, 그러나 젤 소화와 절단의 품질 관리에 대 한 나중 얼룩이 될 수 있다. 그림 2B 는 DNA에서 20, 30 bp 사이 조각 excised 되었습니다 페이지 젤의 대표적인 예를 보여 줍니다. 젤 정화 MNase 조각 성공적인 크기 선택 및 MNase 소화 조각 (그림 2C)의 정화를 페이지 젤 20%에 로드 된. 프로토콜에 선택의 gRNA 식 벡터에 MNase 소화 파편을 수 있도록 사용자 지정 된 링커 시퀀스의 사용와 호환 됩니다. 여기, gRNA-PLKO9 백본으로 사용 되었다. 링커는 표준 PCR를 사용 하 여 gRNA 표정 벡터에서 증폭 된다. 그림 2D 증폭된 링커 순서 없는 추가, 잘못 된 또는 없음 템플릿 amplicons의 대표적인 예를 보여 줍니다. 다음, 링커 amplicons 링커 올바른 방향에서 MNase 소화 조각에 출혈은 되도록 금지 효소로 소화 된다. 예측된 637 및 295 링커의 완전 한 소화를 나타내는 그림 2D 표시 5'과 3' 링커의 agarose 젤 뒷 다리III와 SacII 소화 전후 각각 혈압. 젤 이미지의 오른쪽 부분에는 소화 링커 파편의 절단 문서. 다음 젤 소화 링커의 추출, 프로토콜의 다음 단계는 최종 수리 MNase 소화 파편에 링커의 결 찰. 링커 시퀀스 unphosphorylated 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 생성 되므로, 링커의 각자 결 찰 발생 하지 합니다. 최종 수리 MNase 소화 DNA 파편만 결 찰에 필요한 인산 염 그룹을 제공합니다. 닉 번역에 따라 결 찰 제품은 PCR에 의해 증폭 된다. 라이브러리에서 gRNA 시퀀스의 표현을 왜곡 수 있는 과도 한 PCR 증폭 바이어스를 방지 하기 위해 증폭 총에서 20 사이클 제한 됩니다. PCR, 다음 증폭 제품은 agarose 젤에 시각화 하기가 어렵습니다. 32 주기와 별도 제어 PCRs는 (하지만) 라이브러리 준비를 위해 사용 되지 않습니다 따라서 제품 검색을 수행. 이 컨트롤에서 결과 PCR 그림 2E에 표시 됩니다. 이로써 결 찰 반응을 최적화 하 고 되도록 반응 "조각 제어"에서 가끔 발생 하는 PCR 유물 없는 (NFC). 그림 2E 보여줍니다 원하는 amplicon (5' 링커 DNA 조각 + 3' 링커, 길이: 869 bp) 조각과 링커 시퀀스 간의 아데닌 (1:1) 비율을 사용 하 여 결 찰 반응의 증폭을 다음과 같은.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> 그림 1 : GRNA 라이브러리를 준비 하기 위한 일정을 제안 했다. CORALINA는 어떤 유기 체에서 다른 DNA 소스의 과다에서 포괄적인 gRNA 라이브러리의 생성에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 전략을 제공합니다. 프로토콜에 완료 한 작업 주 동안에 주어질 수 있다. 링커 세대 DNA 끝-수리와 병렬로 수행할 수 있습니다. Electrocompetent 박테리아의 준비 2 일 하룻밤 성장 단계를 포함 하 고 따라서 어셈블리 반응 설정 하기 전에 시작 해야 합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> 그림 2 : 프로토콜 중 중요 한 단계. BAC DNA의 (A) 제어 소화 수 세대의 다양 한 크기의 조각. 여기에 표시 된 MNase 소화의 최적화가입니다. 순화 된 BAC DNA의 원하는 길이 (20-30 bp) DNA 파편을 생성 하는 MNase의 10 분 10 U에 대 한 MNase의 다른 금액으로 대우 되었다. (B) 20, 30 bp polyacrylamide 젤에서 절단을 사용 하 여 사이 조각의 선택 크기. 순화 된 BAC DNA MNase 10 분의 10 U로 대우 되었다. 이미지는 절단에 다음과 같은 기록 했다. (C)의 젤 정화 조각 품질 제어. 젤-정화, 후 1/6th 순화 MNase의 조각 로드 20%에 성공적인 크기 선택 및 정화 확인 페이지 젤. 방향 복제 되도록 링커의 조립 및 금지 효소 소화에 대 한 링커 시퀀스의의 (D) 증폭 5'과 3' 링커 증폭 되었고 각각 HindIII 와 SacII, 잘라. 아니-템플릿 컨트롤 (NTC) PCR 인공 물 및 DNA 오염에 대 한 제어를 포함 했다. 왼쪽: 분석 샘플 응용 프로그램; 오른쪽: 대리점 샘플 응용 프로그램. 이미지는 젤 절단 후 기록 되었다. 성공적인 결 찰 (E) 링커 DNA 파편을 PCR를 사용 하 여 PCR 주기 (32)의 증가 수 및 H2O (NTC)에 아무 템플릿 컨트롤을 수행 하거나 이전 닉 번역 단계에서 NTC를 사용 하 여 제어 분석 될 수 있다 으로 입력 (NTC NT)). 그것은 아무 조각 컨트롤 (NFC), 결 찰 및 있는 MNase 조각 생략 되었다 닉 번역 반응에서 증폭은을 포함 하는 것이 중요. MNase에서 조각 링커 DNA와 결합 되어 샘플 생산 예상된 amplicon만 (869 bp). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

a-universal-protocol-for-large-scale-grna-library-production-from-any

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

11.0K 조회수.  Ludwig-Maximilian-Universität, BioMedical Center. 간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

비디오: A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

연구

환경과학

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

유전학

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

생물학

CRISPRmass를 사용한 고처리량 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리 구축

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. Therefore, we recently developed a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), for high-throughput construction of a genome-wide upstream activating sequence-complementary DNA/open reading frame (UAS-cDNA/ORF) plasmid library. Here, we present a protocol for CRISPRmass, taking as an example the construction of a GAL4/UAS-based UAS-cDNA/ORF plasmid library. The protocol includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. The first step is to linearize the existing complementary DNA (cDNA) or open reading frame (ORF) cDNA or ORF library plasmids by cutting the shared upstream vector sequences adjacent to the 5&#39; end of cDNAs or ORFs using CRISPR/Cas9 together with single guide RNA (sgRNA), and the second step is to insert a UAS module into the linearized cDNA or ORF plasmids using a single step reaction. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. The UAS-cDNA/ORF plasmid library can be utilized for gain-of-function screening in cultured cells and for constructing a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.&#160;

저자 스포트라이트: Simplifying Genome-Wide Plasmid Library Construction Using CRISPRmass

We present a protocol for CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), a method for high-throughput construction of UAS-cDNA/ORF plasmid library in Drosophila using publicly available cDNA/ORF resources. CRISPRmass can be applied to editing various plasmid libraries.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

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CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR)

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly

UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly

UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly